熟地黄多糖诱导肝癌细胞凋亡及对STAT3信号通路的影响

董 静， 孙 阳， 吴勃岩， 王 雪

熟地黄为生地黄的炮制品，始载于《神农本草经》，列为上品，具有滋阴补血、填精益髓的功效。临床上主要用于治疗肝肾阴虚、腰膝酸软、血虚萎黄等病症，并对免疫功能损伤有较好的疗效。熟地黄多糖(rehmannia glutinosa polysaccharide, RGP)作为熟地黄的有效成分之一，具有多方面药理作用，包括增强机体的造血功能、降血压、降血糖、抗氧化等，并且具有保护肝、肾等主要脏器的作用[1]。Huang等发现，RGP能有效促进淋巴结中抗原的暴露，达到诱导保护和长期免疫的作用[2]。Xu等证实，RGP可促进自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)活化并抑制小鼠体内肿瘤[3]。本课题组前期基础工作发现，RGP可调节肿瘤细胞中bcl-2，cyt-c及caspase-3的表达，从而促进细胞凋亡[4]。本研究以H22荷瘤小鼠作为体内抗肿瘤的实验模型，探究RGP对细胞凋亡关键因子[信号转导及转录活化因子(signal transducers and activators of transcription, STAT3)]和凋亡抑制基因生存素(Survivin)的影响，为RGP的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 ICR种小鼠50只，雌雄各半，清洁级，体质量18～22 g(许可证号：SCXK黑2013004，由黑龙江中医药大学GLP中心提供)。

1.1.2瘤株与主要试剂 H22肝癌腹水型瘤株(北京肿瘤研究所)，由ICR小鼠腹水传代。熟地黄(河南同仁堂公司)；RGP(黑龙江中医药大学药学院提取)；环磷酰胺(cytoxan，CY)(批号：131011，上海如吉生物科技发展有限公司)；Survivin试剂盒(批号：BA1420-1)、STAT3试剂盒(批号：BA0621)、TUNEL试剂盒(批号：MK1023)及BCA蛋白定量试剂盒(批号：AR0146)(武汉博士德生物工程有限公司)；STAT3(批号：TA347058)及Survivin(批号：TA301427)多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.1.3仪器 显微镜(日本尼康公司)；石蜡切片机(HM355s，美国Thermo公司)；透射电镜(Tecnai-G2，荷兰Philips公司)；图像采集系统显微镜(BH2-RFCA，日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1RGP的制备 利用水提醇沉法提取，沉淀经无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤后，再经过三氯乙酸溶液脱蛋白后进行烘干，制备RGP。用纯净水分别配制不同质量浓度(1 000，500，250 mg/mL)的RGP溶液，置于4 ℃冰箱保存，用时混匀。

1.2.2实体瘤造模 无菌环境下，将小鼠肝癌H22瘤株接种于小鼠腹腔，待7 d后小鼠腹部丰润时处死，消毒后抽取腹水，生理盐水1∶1混匀，台盼蓝染色后计算活细胞数>95%，制备密度为1×107mL-1的细胞悬液，每只0.2 mL皮下接种于小鼠右侧腋窝[5]。

1.2.3RGP对小鼠移植型肿瘤生长的抑制作用 将50只造模小鼠随机均分为5组，称体质量，分为模型组、CY组及高、中、低剂量RGP组。接种24 h后首次给药，模型组以90 mg/kg生理盐水灌胃；CY组采用40 mg/kg的CY隔日腹腔注射，共3次；高、中、低剂量RGP组分别以1 000，500，250 mg/kg的RGP灌胃。连续给药10 d，末次给药后于小鼠腹部注射6%淀粉溶液1 mL,24 h后注射新鲜配制的1%鸡红细胞悬液2 mL,30 min后以PBS溶液2 mL腹腔注射，轻揉腹部2 min，断髓法处死小鼠，称体质量，剥离瘤组织、胸腺及脾脏。瘤组织固定，酒精消毒后抽取腹腔液涂于载玻片上，固定晾干后经Giemsa染色，油镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况。

1.2.4计算抑瘤率、胸腺(脾脏)指数、吞噬指数及吞噬百分率 各指标按以下公式计算：

抑瘤率(%)=[(模型组平均瘤质量-用药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量]×100%

胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量(mg)/体质量(g)×100%

吞噬百分率(%)=吞噬红细胞的巨噬细胞数/观察记录的吞噬细胞总数×100%

吞噬指数=被吞噬的红细胞总数/观察记录的吞噬细胞总数×100%

1.2.5对凋亡指数的影响 肿瘤组织常规石蜡切片并行H-E染色，采用经典原位末端标记法进行测定，具体方法参照试剂盒说明书进行。经试剂盒处理后，测定凋亡指数(apoptosis index, AI)，每张切片分别选取5个阳性细胞密度高的高倍镜视野，记录凋亡(阳性)细胞数和总细胞数，二者的比值即为AI。阳性表达的细胞以细胞核出现棕黄(褐)色细微颗粒为标志。

1.2.6对STAT3及Survivin表达的影响 采用PV二步免疫组织化学法将经甲醛固定的标本常规脱水，石蜡包埋，切片，PBS冲洗3次；3% H2O2孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗；滴加一抗，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗；DAB室温显色，蒸馏水清洗；苏木精复染，脱水，二甲苯透明封片，光学显微镜下观察，测定STAT3及Survivin的表达情况(按试剂盒说明书操作进行)。STAT3表达的阳性信号是以胞质出现棕褐(黄)色细颗粒为标志；Survivin表达的阳性信号是以细胞质或细胞核出现棕黄色细颗粒为标志。应用Image-proplus 6.0分析软件测定各组中的STAT3及Survivin阳性细胞，统计分析阳性表达的积分吸光度。所有免疫组织化学切片均采用双盲法、由2名病理科教师独立观察，细胞计数测定时均不显示组别等资料。

1.2.7Western-blot法检测STAT3及Survivin蛋白表达 连续给药10 d，末次给药24 h后断髓法将小鼠处死，立即剥离瘤组织，称体质量，细胞裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。模型组、CY组及中剂量RGP组各取样品20 μg上样，SDS-聚丙烯酰胺电泳分离蛋白并转至PVDF膜上，封闭液室温密封10 min，再用抗体反应液处理后的一抗4 ℃孵育过夜，洗膜。经洗涤3次，进行ECL发光显影液显影，应用软件Image J进行分析处理。采用STAT3和Survivin的条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值(相对灰度值)表示肿瘤组织中STAT3和Survivin的表达水平。

2 结 果

2.1药物对H22荷瘤小鼠抑瘤率、免疫器官指数及巨噬细胞功能的影响

2.1.1对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响 高、中、低剂量RGP组均能抑制H22荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长，以中剂量组的抑瘤效果最明显，抑瘤率为45.69%，而CY组的抑瘤率为58.12%，高于RGP各剂量组(表1)。

2.1.2对H22荷瘤小鼠免疫器官指数的影响 各剂量RGP组小鼠的胸腺指数与模型组比较，差别均有统计学意义(P<0.05)；CY组小鼠胸腺指数及脾脏指数与模型组比较均降低，差别有统计学意义(P<0.01)；中剂量RGP组小鼠脾脏指数与模型组比较明显升高，差别有统计学意义(P<0.05)，但低、高剂量RGP组脾脏指数与模型组比较，差别无统计学意义(表1)。

2.1.3对H22荷瘤小鼠巨噬细胞功能的影响 与模型组比较，各剂量RGP组均可提升小鼠的腹腔吞噬指数和吞噬百分率，差别有统计学意义(P<0.05)，而CY组小鼠的腹腔吞噬指数和吞噬百分率则明显降低(P<0.01，表1)。

表1 药物对H22荷瘤小鼠抑瘤率、免疫器官指数及巨噬细胞功能的影响

n=10. RGP：熟地黄多糖. 与模型组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.2对瘤体内细胞形态及凋亡指数的影响 瘤组织经H-E染色后，光学显微镜观察显示，模型组肿瘤中血管丰富，核分裂像较多；CY组及RGP组肿瘤中血管数量少，细胞排列疏松。高、中、低剂量RGP组的凋亡指数分别为(11.2±0.95)，(12.9±0.74)及(9.80±1.03)，与模型组比较，均显著升高(P<0.01，表2，图1)，以中剂量组最高。

RGP： 熟地黄多糖. A：模型组；B：环磷酰胺组；C：高剂量RGP组；D：中剂量RGP组；E：低剂量RGP组.图1 模型组、环磷酰胺组及RGP各组肿瘤组织中凋亡指数的变化(H-E ×200)Fig 1 Changes of apoptosis index in tumor tissue of model group、cytoxan group and RGP group(H-E ×200)

2.3RGP对H22荷瘤小鼠瘤体内STAT3和Survivin表达水平的影响

2.3.1对瘤体内STAT3表达的影响 STAT3蛋白的表达主要是在细胞质出现棕褐(黄)色细颗粒(图2)。积分光密度值(integrated optical density，IOD)结果比较显示，高、中、低剂量RGP组的STAT3的IOD分别为(17 241±2 024)，(16 094±2 297)及(18 066±1 214)，表现为中剂量RGP组对STAT3蛋白表达的抑制作用最强，与模型组比较，差别有统计学意义(P<0.01)；高、低剂量RGP组的STAT3的IOD均比模型组低，差别均有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.3.2对瘤体内Survivin表达的影响 Survivin蛋白的表达主要表现为在细胞质或细胞核出现棕黄色细颗粒(图3)。比较IOD结果显示，高、中、低剂量RGP组的Survivin的IOD分别(20 619±3 158)，(18 531±2 652)及(20 555±4 263)，与模型组比较，差别均有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.3.3Western-blot法检测STAT3及Survivin蛋白表达量 各组均有STAT3或Survivin蛋白表达(图4)，CY组和中剂量RGP组明显低于模型组，差别有统计学意义(P<0.01，表3)。

RGP： 熟地黄多糖. A：模型组；B：环磷酰胺组；C：高剂量RGP组；D：中剂量RGP组；E：低剂量RGP组.图2 模型组、环磷酰胺组及RGP各组瘤体内STAT3表达水平( ×200)Fig 2 Expression of STAT3 in the model group、cytoxan group and RGP group( ×200)

分 组给药量/(mg·kg-1)STAT3/IOD Survivin/IOD AI/%模型组-21184±317126129±42184.20±1.48环磷酰胺组4016785±873.4☆☆18229±628.8☆☆14.9±0.99☆☆RGP组100017241±2024☆20619±3158☆11.2±0.95☆☆50016094±2297☆☆18531±2652☆☆12.9±0.74☆☆25018066±1214☆20555±4263☆9.80±1.03☆☆

n=10. RGP：熟地黄多糖； STAT3：信号转导和转录活化因子； Survivin：生存素； AI：凋亡指数； IOD：积分光密度. 与模型组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

RGP： 熟地黄多糖. A：模型组；B：环磷酰胺组；C：高剂量RGP组；D：中剂量RGP组；E：低剂量RGP组.图3 模型组、环磷酰胺组及RGP各组瘤体内Survivin表达水平( ×200)Fig 3 Expression of Survivin in the model group, cytoxan group and RGP group( ×200)

CY:环磷酰胺； RGP： 熟地黄多糖.图4 RGP对肿瘤组织中STAT3及Survivin蛋白表达量的影响Fig 4 Effect of RGP on STAT3 and Survivin protein expression in tumor tissue

Tab3Expression of STAT3 protein and Survivin protein in tumor tissue of each group

分 组STAT3相对灰度值Survivin相对灰度值模型组0.27±0.030.28±0.22环磷酰胺组0.10±0.04☆0.11±0.02☆熟地黄多糖组0.21±0.04☆0.21±0.02☆

与模型组比较，☆：P<0.01.

3 讨 论

熟地黄被称为“壮水之主，补血之君”，是优良的补益延寿中药。现代药理学研究也表明，熟地黄具有提高免疫、造血、抗肿瘤等诸多作用，其主要成分RGP可升高荷瘤小鼠的免疫器官指数(胸腺指数和脾脏指数)，从而发挥免疫功能。胸腺和脾脏属于外周免疫系统，是产生抗体的重要器官，二者功能和结构的异常将直接影响机体的免疫能力。胸腺是T淋巴细胞分化和成熟的场所，成熟的T细胞亚群再经由血液及淋巴到达各外周免疫器官，发挥免疫作用。脾脏作为体内最大的淋巴器官，不仅具有造血、过滤等功能，还具有接受免疫应激、产生免疫应答的作用，是细胞免疫和体液免疫中心。因此胸腺指数和脾脏指数是衡量人体免疫功能的重要指征。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在抗肿瘤免疫中起着关键作用。张芮琪等发现，植物多糖可激活巨噬细胞，提高吞噬功能，提高非特异性细胞免疫，促进淋巴细胞转化[6]。本实验研究了RGP对荷瘤小鼠免疫器官指数和巨噬细胞功能的影响，推测RGP可能通过激活巨噬细胞而加强吞噬活动、刺激T淋巴细胞发挥免疫功能，从而提高小鼠的免疫能力。Huang等发现，RGP不仅具有免疫刺激作用，还可增强树突细胞的功能，具有成为疫苗佐剂的潜力，RGP在免疫方面的研究前景可观[7]。

凋亡细胞的形态学改变是最直接、最可靠的指标。原位末端标记法作为一种敏感性高、特异性强的细胞凋亡检测技术，能够在组织切片上对凋亡细胞进行精准定位，从形态上更直观地显示细胞的凋亡情况[8]。光学显微镜观察发现，RGP可使肿瘤组织中血管数量减少，肿瘤细胞排列疏松，促进细胞凋亡。

细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达及调控。线粒体作为主要的场所在细胞凋亡过程中发挥着重要的作用，当收到凋亡信号指示时，线粒体会释放多种死亡促进因子，如cyt-c，caspase-3级联反应，导致细胞结构蛋白被切割而凋亡。Survivin是抑制细胞凋亡蛋白家族的成员，经常在肿瘤组织中过量表达，在正常分化组织中少见，因此Survivin被认为是肿瘤治疗中的一个重要靶点[9-10]。Survivin可与细胞凋亡通路中的caspase特异性结合，抑制其活性，而caspase级联反应作为凋亡推进的核心环节，被抑制后将阻碍细胞凋亡[11-13]。Mita等证实，Survivin不仅可抑制细胞凋亡，还可调节细胞周期，参与有丝分裂中纺锤体微管的形成，还与肿瘤干细胞相关，推测Survivin是抑制肿瘤干细胞增殖的潜在靶点[14-15]。本研究发现，模型组Survivin的表达明显升高，RGP组Survivin的表达下降，推测RGP可能具有通过抑制Survivin的表达而起到促进细胞凋亡的作用。

STAT3是STAT信号通路的重要成员，可参与JAK/STAT信号通路，与各种配体结合并激活白细胞介素6、肿瘤坏死因子和血管内皮生长因子等，参与细胞凋亡、肿瘤细胞增殖、分化、血管形成及转移侵袭等相关基因的表达，与肿瘤的发生发展关系密切[16-17]。在多种肿瘤组织中均发现STAT3过度异常表达，已广泛报道于血液学和肿瘤学的相关研究中[18]。STAT3可由不同的生长因子、激素和细胞因子激活，活化的STAT3形成二聚体并转移到细胞核，作为转录因子与特定DNA结合，直接作用于下游靶基因Survivin的启动子，行使基因转录调控功能，促进Survivin激活[19-20]。激活的Survivin直接抑制细胞凋亡中的最重要环节，即caspase级联反应及cyt-c的释放，阻碍了细胞凋亡进程，促使肿瘤细胞逃避凋亡而增殖[21-23]。在正常细胞中，STAT3的激活状态仅能保持数分钟至几小时，持续活化、异常高表达的STAT3在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。Panni等发现，STAT3不仅作用于癌基因的表达，在免疫调节功能方面也有着关键作用[24]。

本研究证实，RGP有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，可使凋亡指数明显上升，可抑制STAT3活化，下调STAT3蛋白表达，并进一步抑制Survivin基因的表达，阻碍细胞凋亡caspase进程，说明RGP可能通过抑制STAT3信号转导通路而促进细胞凋亡。本研究还发现，中剂量RGP组对抑制STAT3和Survivin蛋白表达更有利，促进肿瘤细胞凋亡的作用更强，高剂量RGP组促凋亡效果反而略低，其原因可能是当RGP超过一定浓度时，体内的代谢副产物和原药本身产生竞争抑制而不利于发挥药物活性。RGP抗肿瘤的最佳剂量还需摸索，其促细胞凋亡的分子机制仍需进一步实验加以明确。

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