HPLC法同时测定忍冬叶中9种活性成分的研究

朱金花，王悠悠，庆伟霞,刘绣华,2*，赵东保,3

(1.河南大学 化学化工学院，环境与分析科学研究所，河南 开封 475004；2.河南省天然药物与免疫工程重点实验室，河南 开封 475004；3.河南大学 特种功能材料教育部重点实验室，河南 开封 475004)

HPLC法同时测定忍冬叶中9种活性成分的研究

朱金花1，王悠悠1，庆伟霞1,刘绣华1,2*，赵东保1,3

(1.河南大学 化学化工学院，环境与分析科学研究所，河南 开封 475004；2.河南省天然药物与免疫工程重点实验室，河南 开封 475004；3.河南大学 特种功能材料教育部重点实验室，河南 开封 475004)

为了有效利用忍冬植株，建立了同时检测忍冬叶中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C、木犀草素和槲皮素9种活性成分含量的HPLC分析方法，并用于忍冬叶中活性成分的定量测定，为忍冬叶多指标质量评价标准提供理论依据和方法参考.

忍冬叶；HPLC；9种活性成分同时测定

忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)为传统中药材金银花的药源植物[1]，其花具有广谱抗菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝利胆、降血脂、降血糖、止血等作用[2-7].在临床上对多种疾病均有较好的治疗效果，被广泛地应用在中药制剂、饮料、花茶、保健品等领域，具有广阔的应用前景.在忍冬的种植过程中，忍冬叶的产量是花的10倍左右[8]，但大多作为非药用部位被废弃，造成极大的资源浪费.所以，改善忍冬叶的应用现状，提高忍冬的种植效益是当前亟待解决的问题.

绿原酸和木犀草苷是2015版《中国药典》规定的金银花质量控制指标.绿原酸属于有机酸类，为金银花的主要抗菌有效成分；木犀草苷属于黄酮类，该类物质具有很好的药理活性[9-11].除此之外，忍冬中还含有很多其他的有效成分.文献报道从忍冬叶中分离鉴定出多种黄酮类化合物[12-16].课题组前期研究结果表明，忍冬叶中黄酮化合物的含量要高于花中[17]，并且有研究学者利用胶束介质萃取-HPLC的方法测定了金银花中的绿原酸、芦丁和槲皮素[18].《中国药典》中只规定了绿原酸和木犀草苷是金银花质量控制指标，指标成分较为单一，难以全面衡量金银花药材质量.并且截止到目前为止，还未见同时测定忍冬中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C、木犀草素和槲皮素9种活性物质含量的报道，因此，本实验首次建立 HPLC法同时测定忍冬叶中这9种活性物质含量的方法，以期为忍冬叶进行多指标质量控制提供依据和参考.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪Aglient1200系列(美国安捷伦科技公司)，四元泵G1311A，自动进样器，二极管阵列检测器，色谱柱：COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6×250 mm，5 μm)，水为二次蒸馏水，甲醇、乙睛为色谱纯(默克股份有限公司)，冰乙酸为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司).

对照品：新绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷(四川省维克奇生物科技有限公司)；芦丁(Aladdin-阿拉丁试剂(上海)有限公司)，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(本实验室自制，含量≥98%)；木犀草素、绿原酸、咖啡酸、槲皮素(中国药品生物制品检定所).忍冬叶采于河南大学金明校区药用植物园内，经河南大学药学院李钦教授鉴定为忍冬科忍冬属植物忍冬的叶子.

1.2 供试品溶液的制备

将忍冬叶样品40 ℃烘干至恒重，粉碎过60目筛.精密称取样品2 g，置索氏提取器中，加120 mL石油醚脱脂至无色，脱脂粉末晾干后用80%甲醇100 mL，80 ℃下回流提取3次，每次3 h，合并甲醇提取液，减压浓缩至干，用甲醇溶解，定容至50 mL的容量瓶中，作为供试品溶液，备用.进样前用0.45μm有机滤膜过滤.

1.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品木犀草素2.0 mg、木犀草苷4.6 mg、绿原酸5.5 mg、异绿原酸C 2.9 mg、新绿原酸1.3 mg、金丝桃苷4.6 mg、芦丁6.2 mg、槲皮素1.9 mg、咖啡酸1.6 mg.置同一25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成混合对照品溶液.

1.4 色谱条件

采用COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm，5μm) 色谱柱，流动相为乙腈 (A) -0.5% 醋酸 (B)，梯度洗脱 (0～10 min，12%～20% A；10～20 min，20% A；20～45 min，20%～30% A)，流速1 mL/ min.检测波长λ= 327 nm；温度t= 25 ℃；进样量：10μL.按上述条件可以将9种物质分离开.对照品和供试品色谱图如图1所示.

1.新绿原酸， 2.绿原酸， 3.咖啡酸,4.芦丁,5.木犀草苷,6.金丝桃苷,7.异绿原酸C,8.木犀草素,9.槲皮素.图1 对照品(A)和供试品(B)的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and sample (B)

2 方法学考察

2.1 线性关系的考察

将上述对照品溶液用甲醇稀释至不同浓度梯度，取上述不同浓度的混合标准品溶液10 μL进样分析，分别以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X(mg/L)为横坐标进行绘制标准曲线.9种分析物的线性方程见表1.

2.2 精密度、重现性和稳定性

按1.3项下方法制备对照品溶液，1.4项下方法进行检测，重复测定5次，记录峰面积，计算新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C和木犀草素的RSD分别为1.47%,1.74%,0.55%,1.58%,0.49%,2.11%,3.73%,3.78%.表明仪器精密度良好.

精密称取忍冬叶粉末2 g，平行5份，按1.2项下方法制备供试品溶液，1.4项下方法进行检测，记录峰面积，计算得到新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C和木犀草素峰面积的RSD分别为1.52%,1.64%,0.93%,1.38%,0.67%,3.21%,2.73%,3.53%.表明该方法重现性良好.

精密称取忍冬叶粉末2 g，按1.2 项下方法制备供试品溶液，分别在室温下放置0、4、8、12、16、20、24 h进行检测，计算得到新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C和木犀草素峰面积的RSD分别为1.27%,1.51%,0.60%,1.42%,0.46%,1.94%,3.34%,3.33%.表明供试品溶液在24 h内稳定性良好.

2.3 加标回收率

精密称取忍冬叶粉末2 g，平行3份，分别加入一定量的混合对照品，按1.2项下方法制备供试品溶液，按照1.4方法进行测定，记录峰面积，计算各成分的回收率.新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C、木犀草素和槲皮素的平均回收率分别为97.13%,96.93%,101.82%,100.12%,98.89%,97.70%,98.16%,99.17%,99.97%，RSD分别为2.76%,2.22%,4.06%,0.91%,0.44%,1.76%,0.61%,1.37%,0.59%,9个成分的回收率在96.93%～101.82%之间，表明该方法准确度较高.

2.4 样品的测定

取忍冬叶待测样品，按上述实验条件进行测定.结果如表2.

表1 9种分析物的回归方程、相关系数及线性范围Table 1 Calibration curves,correlation coefficients and linear ranges of 9 analytes

表2 忍冬叶中9 种成分的含量(n=3)Table 2 9 analytes in leaves of Lonicera japonica Thunb (n=3)

注：采摘时间为2015年2月

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

绿原酸和木犀草苷是《中国药典》规定忍冬质量的控制指标，而忍冬成分复杂，单以绿原酸和木犀草苷作为指标性成分，不能全面反映忍冬质量.本实验建立HPLC同时测定忍冬叶中9 种较稳定活性成分(新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C、木犀草素和槲皮素)的含量，以及对相应的方法学进行考察.所有化合物均在327 nm左右有较大的吸收，故选327 nm作为检测波长.分别考察了乙腈-水和甲醇-水溶液为流动相对9种成分的分离，实验结果表明乙腈-水溶液为流动相的色谱峰峰型和分离度均良好，且保留时间短，故选其作为流动相；在该流动相体系中，部分待测化合物峰形对称性较差，故又考察了乙腈-(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)醋酸水溶液，结果显示在乙腈-0.5%醋酸水溶液条件下效果最好，各个成分在45 min内洗脱,且得到良好的分离.

3.2 测定结果讨论

从测定结果(表2)来看，忍冬叶中9种物质的含量差异较大，异绿原酸C和绿原酸的含量相对较高，其次是木犀草苷和芦丁，木犀草素和咖啡酸的含量相对较低，在该实验条件下，未检出槲皮素.据文献报道，张芳等[19]曾对山东5个不同变异类型的忍冬进行研究，发现槲皮素的含量在0.001 1%～0.007 1%之间；辛华等[20]测得结果显示：山东金银花中槲皮素只有0.12 mg/g，遂意弄椿红腺、北更加乐红腺、北更植仁红腺、北更内仁红腺等品种未检出槲皮素.为进一步确证所分析样品中是否含有槲皮素，采用加大被提取样品用样量、加大待测液浓度以及选用超声法等进行提取，均未能检出槲皮素.另外，对一年内其他所有月份采摘的忍冬叶进行槲皮素的分析，也未检出.由此推断该品种的忍冬叶中可能不含槲皮素或其含量极微.

4 结论

本实验中我们建立的HPLC定量分析方法，能同时测定9种活性成分的含量，且稳定、可靠、效率高、重复性好，可以为忍冬叶活性成分进一步研究提供依据和参考.

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[责任编辑：吴文鹏]

Determination of nine active constituents in the leaves ofLonicerajaponicaThunb by HPLC

ZHU Jinhua1,WANG Youyou1,QING Weixia1,LIU Xiuhua1,2*,ZHAO Dongbao1,3

(1.InstituteofEnvironmentalandAnalyticalSciences,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.KeyLaboratoryofNaturalMedicineandImmune-EngineeringofHenanProvince,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 3.KeyLabForSpecialFunctionalMaterials,MinistryofEducation,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

In order to effectively utilize the individual plant ofLonicerajaponicaThunb,a method to determine the contents of nine bioactive compounds (neochlorogenic acid,chlorogenic acid,caffeic acid,rutin,galuteolin,hyperoside,isochlorogenic acid C,luteolin and quercetin) in leaves ofLonicerajaponicaThunb was established by HPLC.The method was applied to determine the 9 active ingredients in the leaves.It can apply to evaluate the quality of the leaves ofLonicerajaponicaThunb.

leaves ofLonicerajaponicaThunb; HPLC; simultaneousl determination of 9 components

2016-09-23.

河南省科技攻关计划项目(152102210257),河南省高等学校重点科研项目(16A150028,14B150017),河南省高校科技创新团队项目(14IRTSTHN030).

朱金花(1982-),女,副教授,研究方向为色谱技术的理论及应用研究.*

,E-mail:liuxiuhua@henu.edu.cn.

R284.2

A

1008-1011(2017)01-0070-05