Src表达与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的相关性研究*

董玲玲，玉素甫·买买提，王昶文，黄 韬△，克力木·阿不都热依木△

1华中科技大学同济医学院附属协和医院乳腺甲状腺外科，武汉 4300222新疆维吾尔自治区人民医院微创外科，乌鲁木齐 830001

Src表达与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的相关性研究*

董玲玲1，玉素甫·买买提2，王昶文1，黄 韬1△，克力木·阿不都热依木2△

1华中科技大学同济医学院附属协和医院乳腺甲状腺外科，武汉 4300222新疆维吾尔自治区人民医院微创外科，乌鲁木齐 830001

目的 研究甲状腺乳头状癌组织中Src的表达与中央区淋巴结转移及其他临床病理特征的相关性。方法 采用组织芯片和免疫组织化学技术对88例甲状腺乳头状癌患者组织标本中的Src进行检测。采用卡方检验分析Src的表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系，采用Logistic回归模型分析中央区淋巴结转移的危险因素。所有数据分析均使用SPSS 22.0统计软件。结果 88例甲状腺乳头状癌组织中Src阳性率为43.2%，在中央区淋巴结转移阳性组，Src阳性率为65.0%，卡方检验结果表明Src的表达与中央区淋巴结转移、TNM分期显著相关(均P<0.05)，Src的表达与年龄、性别、肿瘤大小、癌灶多少、甲状腺包膜浸润无相关关系(均P>0.05)。Logistic回归分析结果显示Src阳性是甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的独立危险因素(P<0.05)。结论 Src的表达与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移密切相关，检测Src表达水平可能有助于临床决策，Src抑制剂或可作为甲状腺乳头状癌术后颈部淋巴结复发和转移的新型靶向治疗药物。

甲状腺乳头状癌； 中央区淋巴结转移； Src； 组织芯片

甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的病理类型，自然病史长，预后好，手术治疗效果最佳。在甲状腺乳头状癌患者中，超过一半的患者初诊即发现颈部中央区淋巴结转移[1]。甲状腺切除联合颈部中央区淋巴结清扫成为甲状腺乳头状癌经典的手术方式。目前的争议在于，术前影像学评估为cN0的甲状腺乳头状癌患者是否有必要在甲状腺切除的同期手术中联合预防性中央区淋巴结清扫[2]。年龄大于45岁，伴有颈部淋巴结转移的患者总生存期显著下降[3]，提示甲状腺乳头状癌术后颈部淋巴结的转移和复发需密切随访。找到一个预测颈部淋巴结转移的生物学指标，可能有助于临床决策。Src是由c-Src原癌基因编码的蛋白质，是Src激酶家族的成员，参与癌细胞的增殖、分化、侵袭[4]及上皮细胞-间充质转换[5]。在甲状腺乳头状癌小鼠模型中应用Src抑制剂，癌细胞的生长、浸润及远处转移受到显著抑制，患病小鼠总生存期显著延长[6]，但是Src的表达与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的相关性并不明确。我们采用组织芯片和免疫组织化学技术，探讨Src的表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征及中央区淋巴结转移的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

组织芯片购自上海国家生物芯片工程公司，原发性甲状腺乳头状癌患者的病理标本88例。在每个甲状腺乳头状癌组织的外围取1个直径1.5 mm的标本，注意避免坏死的肿瘤组织，这些标本组成组织芯片队列，采用免疫组织化学染色法检测癌组织中Src的表达水平。所有患者具有完整的临床病理资料，发病年龄14～91岁，平均年龄(49.8±13.9)岁。所有患者行甲状腺切除联合颈部中央区淋巴结清扫术，术前均没有头颈部手术史及其他恶性肿瘤病史、放疗史，术前检查均未发现远处转移，术后切除组织全部送检，病理诊断均为甲状腺乳头状癌，病理分期全部采用2010年美国癌症联合委员会(AJCC)第7版TNM分期法。

1.2 免疫组织化学染色方法

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法检测甲状腺乳头状癌组织中Src的表达。实验用Src抗体来自CST公司，SP免疫组织化学试剂盒来自Dako公司。已知的阳性组织切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。实验步骤：①脱蜡，梯度乙醇水化；②内源性过氧化物酶阻断剂37℃孵育10 min，PBS洗涤3次，每次5 min；③枸橼酸缓冲液(pH6.0)中煮沸15～20 min，自然冷却20 min，快速冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5 min；④滴加正常血清封闭液，37℃孵育10 min，滴加Src单抗，4℃冰箱孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加SP试剂，37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；⑤滴加二氨基联苯胺(DAB)显色剂，苏木精复染，脱水，封片，显微镜下观察。

1.3 免疫组织化学结果判定

由2位经验丰富的病理科医师对所有标本进行独立的结果判定，此过程采用双盲法。根据切片阳性细胞率(阳性细胞占标本肿瘤细胞百分比)和阳性细胞着色强度分别记分；阳性细胞中核膜和胞质染色为棕黄色，阳性细胞率：0～记1分，11%～记2分，34%～记3分，≥67%记4分；细胞着色强度：未着色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。将上述两项得分相加即为标本的Src免疫组织化学评分，4～7分记为Src阳性表达，0～3分记为Src阴性表达。

1.4 统计学方法

所有数据分析均采用SPSS 22.0统计软件。应用描述性统计分析88例甲状腺乳头状癌患者的临床病理特征，应用χ2检验和Fisher精确概率法分析组间差异，建立Logistic二元回归模型进行单因素、多因素分析并计算风险比(HR)，评价临床病理特征及Src的表达对于甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的风险，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺乳头状癌组织中Src的表达

共88例甲状腺乳头状癌患者纳入本研究，根据免疫组化检测结果将患者分为Src阳性组和Src阴性组，Src染色阳性反应以胞膜为主，呈棕黄色颗粒，见图1。

A：甲状腺乳头状癌中Src阴性表达；B：甲状腺乳头状癌中Src阳性表达图1 Src在甲状腺乳头状癌组织中的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.1 Expression of Src in papillary thyroid carcinoma(immunohistochemical staining,×400)

2.2 甲状腺乳头状癌组织中Src的表达与临床病理特征的关系

本研究中，38例甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中Src表达阳性，50例甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中Src表达阴性，Src阳性率43.2%。Src的表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的相关性分析结果见表1。在40例中央区淋巴转移阳性患者中，Src阳性率为65.0%，在48例中央区淋巴结转移阴性患者中Src阳性率为25.0%，卡方检验显示Src的表达与中央区淋巴结转移显著相关(P<0.05)。与病理分期Ⅰ～Ⅱ期的患者相比，病理分期Ⅲ～Ⅳ期的患者Src阳性率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。Src的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、癌灶多少、甲状腺包膜浸润无相关性(均P>0.05)。

表1 Src的表达与88例甲状腺乳头状癌患者临床病理特征的关系Table 1 Relationship between Src expression and clinicopathological characteristics of papillary thyroid carcinoma in 88 patients

a：皮尔逊卡方；b：Fisher精确概率法

2.3 甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移危险因素的单因素、多因素分析

使用Logistic二元回归模型分析甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的风险因素，结果见表2。我们分析了年龄、性别、肿瘤大小、癌灶多少、甲状腺包膜浸润与中央区淋巴结转移的关系，单因素及多因素分析结果显示，Src阳性是甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的独立危险因素(P<0.05)，年龄≥45岁是中央区淋巴结转移的非独立危险因素(P<0.05)，而性别、肿瘤大小、癌灶多少、甲状膜包膜浸润不能显著影响甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移(均P>0.05)。

表2 甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移危险因素的二元Logistic回归分析Table 2 Logistic regression analysis of risk factors for central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma

HR：风险比；CI：可信区间

3 讨论

Elsberger等[7]的研究结果显示，Src在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤中高表达，与肿瘤的不良预后密切相关。Cho等[8]报道，Src的表达在甲状腺癌灶中显著上调，与甲状腺良性病灶中Src的表达有显著差异(60%vs.0%，P<0.05)。本研究中Src阳性率为43.2%，低于相关文献报道，可能是由于本研究中Src阳性表达的判断标准相对严格，导致Src阳性表达率偏低。Src与多种细胞膜表面受体酪氨酸激酶相互作用，参与丝裂原活化蛋白激酶信号通路、信号转导和转化激活因子3信号通路、磷酸肌醇-3激酶-蛋白激酶信号通路、FAK焦点黏着激酶信号通路等，以高度活化状态参与癌细胞的分化、迁移、血管生成及存活[9]。在甲状腺乳头状癌细胞中单独使用Src抑制剂达沙替尼或者Si-Src可以显著抑制癌细胞的生长和增殖[10]。王丽等[11]研究Src的表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的相关性，发现Src的表达与肿瘤大小及颈部淋巴结转移显著相关。本研究结果显示，Src的表达水平与甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移、TNM分期显著相关，中央区淋巴结转移阳性患者较淋巴结转移阴性患者Src阳性率高，肿瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期的癌灶相比，Src阳性率显著增加，进一步说明Src高表达与甲状腺乳头状癌细胞的发生、发展及浸润有关，这与多数研究结果一致[6-11]。但是在本研究中，Src阳性与肿瘤大小、癌灶多少、甲状腺包膜浸润不相关，与部分研究结果不符[11-12]，可能是由于实验取材位置距离甲状腺乳头状癌肿瘤中心的远近不等所致。

甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移阳性患者中Src高表达，推测Src阳性可能促进甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移。Ischenko等[13]研究表明在胰腺癌细胞中，Src抑制剂可以抑制孤立淋巴管上皮细胞的增殖和迁移能力，在淋巴管瘤小鼠体内，Src抑制剂可以减少新生淋巴管瘤的形成。由于肿瘤的淋巴结转移与淋巴管生长关系密切，我们可以认为Src在肿瘤细胞淋巴结转移过程中发挥了重要作用，并且，在前列腺原位癌裸鼠模型中，Src抑制剂达沙替尼被证实可以减少癌细胞淋巴结转移的发生率[14]。在本研究中，单因素和多因素分析结果显示，Src阳性表达是甲状腺乳头状癌患者中央区淋巴结转移的独立危险因素，进一步证实Src在甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的过程中起到关键作用。此外，本研究结果显示年龄≥45岁是甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的非独立危险因素，结合Zaydfudim等[3]的研究结果，对于年龄大于45岁的甲状腺乳头状癌，必须警惕其颈部淋巴结转移。

综上所述，Src的表达与甲状腺乳头状癌的发生、发展及浸润有关，Src高表达与颈部中央区淋巴结转移关系密切。甲状腺乳头状癌组织中Src高表达比Src低表达的患者在甲状腺癌术后更加需要密切随访，警惕颈部淋巴结的转移或复发，同时，Src抑制剂可能成为甲状腺乳头状癌术后颈部淋巴结复发和转移的新型靶向治疗药物。

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(2016-10-18 收稿)

Relationship between Src Expression and Central Lymph Node Metastasis of Papillary Thyroid Carcinoma

Dong Lingling1，Yusufu Maimaiti2，Wang Changwen1etal

1DepartmentofBreastandThyroidSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China2DepartmentofGeneralSurgery(ResearchInstituteofMinimallyInvasion)，People’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830001，China

Objective To investigate the relationship between the expression of Src and clinicopathological characteristics，and evaluate influence of Src on central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.Methods Tissue microarray and immunohistochemistry technique were used to detect Src expression in papillary thyroid carcinoma tissues of 88 cases.Chi-square test was used to assess the relationship between Src expression and clinicopathological characteristics，and logistic regression model was used to investigate the risk factors for central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.All data were analyzed by using SPSS statistics version 22.0 software.Results In the papillary thyroid carcinoma tissues of 88 patients，Src positive rate was 43.2%，and in group of patients with central lymph node metastasis，Src positive rate was 65.0%.Chi-square test showed that Src expression was significantly associated with central lymph node metastasis(P<0.05)and TNM stage(P<0.05)，and Src expression was not significantly correlated with tumor age，gender，tumor size，cancer lesion number，or thyroid capsule invasion(allP>0.05).Logistic regression analysis showed Src was an independent risk factor for central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma(P<0.05).Conclusion Src expression is strongly linked to central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.Testing Src expression level may be helpful to decide therapeutic strategies and Src inhibitor may be a new target therapeutic drug for cervical lymph node recurrence and metastasis of postoperative papillary thyroid carcinoma.

papillary thyroid carcinoma； central lymph node metastasis； Src； tissue microarray

*华中科技大学自主创新基金资助项目(No.0118530088)

董玲玲，女，1990年生，硕士研究生，E-mail：lcyxdll@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：huangtaowh@163.com(黄 韬);E-mail：klm6075@163.com(克力木·阿不都热依木)

R736.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.010