Toll样受体4在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及厄贝沙坦的干预作用*

张 莉,王 瑜,杜桂英,程玉花,吕金雷，陈钦开

南昌大学第一附属医院肾内科，南昌 330006

Toll样受体4在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及厄贝沙坦的干预作用*

张 莉,王 瑜,杜桂英,程玉花,吕金雷△，陈钦开

南昌大学第一附属医院肾内科，南昌 330006

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)信号通路与糖尿病肾病(DN)的关系及使用血管紧张素受体拮抗剂(ARB)干预对TLR4信号通路的影响，探讨其肾脏保护机制。方法 研究对象为2012年7月至2014年6月在南昌大学第一附属医院肾内科住院的糖尿病肾病患者，使用ARB厄贝沙坦治疗的为ARB组，未使用的患者为DN组，泌尿外科行肾脏切除的患者为对照组(C组)，收集各组患者血液检测血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)，留取尿液测24 h尿蛋白定量等临床指标；病理常规染色和特殊染色观察各组患者肾组织病理变化；免疫组化法检测各组患者肾组织TLR4及相关炎症因子表达水平。结果 DN组：血肌酐(235.8±21.8)μmol/L、血尿素氮(13.7±4.9)mmol/L、24 h尿蛋白定量(4.41±1.12)g；ARB组：血肌酐(217.7±22.7)μmol/L、血尿素氮(8.9±1.5)mmol/L、24 h尿蛋白定量(3.25±0.89)g；C组：血肌酐(51.6±29.6)μmol/L、血尿素氮(4.6±1.5)mmol/L、24 h尿蛋白定量(0.11±0.04)g;DN组均高于ARB组及C组(均P<0.05)。病理染色结果显示:C组肾小球和肾小管未见明显变化；ARB组肾小球毛细血管球肥大，基底膜轻度增厚，系膜轻度增生，肾小管上皮细胞显示空泡和颗粒变性，肾间质和小动脉无明显病变；DN组肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚，系膜基质增生甚至有些肾小球的系膜基质重度增生，形成结节状硬化。免疫组化结果显示:TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达，DN组较ARB、C组表达均增高(均P<0.05)，ARB组较C组表达增高(均P<0.05)。TLR4与MyD88、NF-κB、MCP-1、TNF-α的表达量呈正相关(r分别为0.940、0.963、0.934、0.929，均P<0.05)。结论 糖尿病肾病患者体内TLR4信号通路被激活，使用厄贝沙坦可阻断TLR4信号通路，减轻患者肾功能损害，提示阻断TLR4信号通路可能成为治疗糖尿病肾病的新方法。

糖尿病肾病； 血管紧张素受体拮抗剂； Toll样受体4； 炎性因子

近年来关于炎症免疫反应与糖尿病肾病(DN)关系的研究较多，1998年国外有学者提出糖尿病(主要是2型)实际上是“天然免疫系统病”的观点，Toll样蛋白受体(TLRs)是重要的天然免疫受体。人体有11个TLRs(TLR1～TLR11)，其中TLR4是研究最早和最多的，TLR4在识别脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)及介导炎症反应信号转导中起重要作用[1]，且与DN肾损伤关系密切。TLR4在正常肾脏系膜细胞、肾小管上皮细胞可少量表达[2]，研究证实在DN模型鼠肾组织中TLR4高表达。TLR4介导的信号通路包括髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖性途径和MyD88非依赖性途径。TLR4与相应的配体结合后，可启动快速的信号传递，引起核因子-B(NF-B)的活化或Ⅰ型干扰素的产生，从而引起下游炎症因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等释放增加[3]。在糖尿病患者体内，肾组织肾素血管紧张素醛固酮系统(RAS)局部被激活，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)表达增加，研究表明AngⅡ可刺激体外培养的肾小球系膜细胞TLR4表达上调[4]。我们前期研究发现DN模型大鼠较正常大鼠TLR4表达增加，使用血管紧张素受体拮抗剂(angiotension receptor blocker,ARB)干预后TLR4表达降低，肾功能损害减轻[5]。但目前关于人体肾脏局部RAS激活、TLR4信号通路和DN之间关系的研究鲜见报道。本研究的对象为行肾脏病理活检诊断为DN的患者，且以泌尿外科行肾脏切除的无肾病患者为对照，研究人体TLR4信号通路与DN的关系，探讨TLR4信号通路在DN发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2012年7月至2014年6月在南昌大学第一附属医院肾内科住院行肾活检，确诊为糖尿病肾病的患者，其中使用厄贝沙坦每天150 mg，持续1～2月治疗的患者为ARB组，未使用ARB治疗的为DN组，同期在南昌大学第一附属医院泌尿外科行肾脏切除的非糖尿病肾病患者为对照组(C组)，所有患者肌酐<264 μmol/L，血压正常，所有DN治疗患者未使用其他可能影响TLR4表达的药物。排除标准：合并原发性肾小球肾炎、肾血管狭窄、合并严重心肺疾病、近1月发生糖尿病急性并发症及感染、结缔组织病、自身免疫性疾病的患者。

1.2 标本采集和处理

DN组和ARB组患者均在B型超声引导下，行经皮肾活检穿刺；C组取切除肾脏中远离病变组织5 cm以上，病理检查未被浸润的肾皮质。肾组织分别用10%甲醛溶液固定，经苏木精-伊红(HE)、Masson染色用作光镜检查，置于液氮中用于免疫组化检测。

1.3 生化指标测定

清晨空腹卧位，肘静脉采血，用于测定患者血肌酐、血尿素氮、空腹血糖、血脂、C-反应蛋白、糖化血红蛋白、血白蛋白；餐后2 h抽血测血糖；留取24 h尿液测尿总蛋白定量。

1.4 肾组织病理形态学观察

经10%甲醛溶液固定的肾组织常规包埋，按3 μm的厚度行连续切片，行HE、Masson染色，光学显微镜下观察。

1.5 免疫组化染色

3 μm石蜡切片脱蜡，清水清洗片子至干净透明，将片子置入枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)于不锈钢高压锅中抗原修复，冷却至室温后，蒸馏水洗3～5次，PBS溶液洗2 min×3次。将组织所在区域用笔画圈圈入，同时在圈内滴加PBS溶液，防止组织干燥；在免疫组化标记的圈内滴加一抗(TLR4：1∶50，MyD88：1∶400，NF-B：1∶60，MCP-1:1∶125，TNF-α：1∶60)，4℃过夜；室温放置20 min，吸弃一抗，PBS溶液冲洗3次；甩干片子，滴加二抗，37℃孵育30 min后，PBS溶液冲洗3～5次；DAB显色，苏木精复染1 min，盐酸溶液分化，饱和碳酸铝溶液蓝化，常规脱水，透明，中性树脂封片，每项检测均设阴性对照，以PBS代替一抗。光学显微镜下观察、拍照。肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞染成黄色或棕色为阳性，每张切片至少观察20个不重复高倍镜视野(×400)，通过观察细胞染色阳性的强度及范围来进行评分，染色程度评分方法：阴性计0分，浅黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分；染色范围评分方法按阳性比例1%～ 1分、26%～ 2分、51%～ 3分及76%～4分。以同一患者同一抗原的阳性强度和阳性范围的评分乘积进行统计，取其平均值作为该抗原在该患者肾组织中的表达水平。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 基本情况

符合标准的DN组患者18例，男性12例，占67%，年龄37～63岁，平均年龄(52.0±9.1)岁；ARB组18例，男性12例，占67%，年龄36～65岁，平均年龄(50.0±7.3)岁；C组6例，男性4例，占67%，年龄38～62岁，平均年龄(51.0±8.5)岁。C、ARB、DN组性别、年龄、体重指数、血压等差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。

2.2 临床指标

3组相比，空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、三酰甘油、总胆固醇水平，ARB、DN组均较对照组高(均P<0.05)，DN、ARB之间无差异(均P>0.05)；血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白、CRP水平，ARB、DN组均较对照组高(均P<0.05)，DN组较ARB组增高(均P<0.05)；血白蛋白水平、肌酐清除率(Ccr)，ARB、DN组均较对照组低(均P<0.05)，DN组较ARB组低(均P<0.05)(表2)。

组别n性别(男/女)年龄(岁)体重指数(kg/m2)收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)C64/252.0±9.123.0±0.9128.4±9.373.0±10.4ARB1812/650.0±7.323.3±0.7127.8±11.175.8±9.8DN1812/651.0±8.523.4±0.1127.6±9.378.1±8.8

C：对照组；ARB：糖尿病肾病患者使用ARB治疗组；DN：糖尿病肾病患者未使用ARB治疗组

组别n血糖(mmol/L)餐后2h血糖(mmol/L)糖化血红蛋白(%)总胆固醇(mmol/L)三酰甘油(mmol/L)血肌酐(μmol/L)C65.4±0.75.7±1.35.4±0.64.6±0.41.5±0.451.6±29.6ARB187.2±0.8**10.6±1.2**7.5±0.3**7.3±0.4**2.5±0.4**217.7±22.7**DN187.1±0.9**10.5±1.4**7.4±0.4**7.4±0.4**2.3±0.5**235.8±21.8**△

组别血尿素氮(mmol/L)24h尿蛋白(g)血白蛋白(g/L)CRP(mg/L)Ccr(mL/min)C4.6±1.50.11±0.0440.3±5.02.28±0.80103.60±12.34ARB8.9±1.5*3.25±0.89**30.3±2.1**5.02±0.89*42.67±2.50**DN13.7±4.9**△4.41±1.12**△24.5±6.1**△7.31±1.71**△33.95±2.86**△△

与C组比较，*P<0.05**P<0.01；与ARB组比较，△P<0.05△△P<0.01

2.3 肾组织病理变化

HE、Masson染色均显示DN组患者肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚，肾小球系膜基质增生，有些形成结节状硬化，间质淋巴单核细胞浸润，伴有纤维化，小动脉管壁内膜增厚；ARB组肾小球毛细血管球肥大，基底膜轻度增厚，系膜轻度增生，肾小管上皮细胞显示颗粒和空泡变性，肾间质和小动脉无明显病变；C组：肾小球和肾小管未见明显病变(图1)。

2.4 肾组织TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1、TNF-α的表达

免疫组化检测结果提示，TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1、TNF-α在DN组患者肾小球系膜区和肾小管中表达面积和强度均较ARB、C组明显增加(均P<0.05)，ARB组患者表达面积和强度较C组增加(均P<0.05)，对照组少量表达(图2、图3、表3)。

图1 各组患者肾组织HE、Masson染色的病理变化(×200)Fig.1 Pathological changes of kidney tissues with HE and Masson staining in the three groups(×200)

图2 各组患者肾组织TLR4、MyD88的表达(免疫组化，×200)Fig.2 Expression of TLR4 and MyD88 in the three groups(immunohistochemistry，×200)

图3 各组患者肾组织NF-κB、MCP-1、TNF-α的表达(免疫组化，×200)Fig.3 Expression of NF-κB，MCP-1 and TNF-α in the three groups(immunohistochemistry，×200)

组别nTLR4MyD88NF-κBMCP-1TNF-αC61.00±0.700.80±0.451.20±0.451.40±0.551.20±0.45ARB185.67±1.67**4.08±1.24**6.17±1.58**6.50±1.51**6.33±1.44**DN188.25±1.99**▲▲6.35±1.90**▲▲8.65±2.01**▲▲9.10±1.92**▲▲8.85±1.90**▲▲

与C组比较，**P<0.01；与ARB组比较，▲▲P<0.01

2.5 TLR4与MyD88、NF-κB、MCP-1、TNF-α的相关性分析

Pearson相关性分析结果提示，TLR4与MyD88、NF-κB相关系数分别为0.940和0.963(均P<0.05)。TLR4与MCP-1、TNF-α相关系数分别为0.934和0.929(均P<0.05)。

3 讨论

DN是糖尿病患者最主要的微血管病变，是引起终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因，也是糖尿病患者的主要死亡原因。在美国、日本及许多西欧国家，2型糖尿病和ESRD作为共病逐年在增加，DN成为ESRD首位病因[6]，几乎占ESRD的40%以上[7]。在我国，随着生活水平的提高，DN发病率亦呈逐年上升趋势。因此关于DN的研究已得到医学界高度重视。1型和2型糖尿病均可引起DN，糖尿病90%以上为2型糖尿病，2型DN占主导地位[8]，因此本实验研究对象为2型DN。

DN的主要病理变化为肾小球的毛细血管球肥大，肾小球基底膜增厚，系膜增生，肾小管基底膜增厚、间质淋巴单核细胞浸润、纤维化以及动脉硬化。本研究肾组织HE、Masson染色可见DN组患者肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜增生，有些系膜重度无细胞性增生，形成结节状硬化，肾小管基底膜增厚、间质可见大量淋巴细胞浸润。正常对照组肾小球和肾小管未见上述变化。

DN发病机制复杂[9]，至今尚未完全明确。大多数学者认为糖代谢障碍所致的血糖过高，在一定的遗传背景以及相关的获得性危险因子参与下，通过启动许多细胞因子的网路，造成全身一些重要脏器的损害，其中肾脏损害即为DN。DN患者持续高血糖引起糖基化终末产物(AGEs)形成增加，AGEs可与AGEs受体结合，刺激体内合成TNF、MCP-1等[10]，促进肾脏炎症损伤，导致系膜细胞增殖，细胞外基质增生。新的观点认为非感染状态下的炎症反应在DN发病机制和进展过程中发挥着重要作用[11]，体外细胞培养实验证明，高糖培养液能刺激细胞分泌MCP-1，有研究发现DN患者血浆中CRP、TNF-α、IL-1、IL-6等炎症反应标志物浓度明显增高[12]。可见炎症反应在DN发病机制中起着重要的作用。自从天然免疫反应参与了DN的发生与发展的观点提出后，TLR4与DN的相关研究相继出现[13]。TLR4介导的信号转导通路主要为MyD88依赖性途径，配体包括内源性和外源性，脂多糖(LPS)是TLR4最主要的外源性配体，宿主体内组织损伤和物质降解所产生的热休克蛋白、纤维蛋白原、细胞外基质降解成分等也可激活TLR4，为TLR4内源性配体，当TLR4与相应配体结合后引起相关炎症因子激活从而启动炎症反应，TLR4不仅能识别细菌LPS引起炎症反应，还可识别内源性配体引起非感染性炎症反应[14]。高糖环境可诱导人肾小管上皮细胞TLR4的表达，有研究证明TLR4的活化能诱导NF-κB激活[15]，启动IL-1、6、8，TNF-α表达，促使细胞趋化因子的释放以及巨噬细胞的浸润。在2型DN患者外周血单核细胞中TLR4增加，且与TNF-α、MCP-1表达量呈正相关[16-17]。DN患者肾组织基底膜增厚和细胞外基质增生，增生的细胞外基质是TLR4的内源性配体，可刺激TLR4合成增加，TLR4与其结合后激活NF-κB，引起相关细胞因子产生增加，导致肾组织炎症反应，损伤的肾组织可暴露出TLR4内源性配体，如纤维蛋白原、纤维连接蛋白等，诱导TLR4的表达，形成恶性循环[18]。本研究免疫组化结果显示，DN患者肾组织中TLR4表达量较对照组增加(P<0.05)，且与MyD88、NF-κB，以及炎症因子TNF-α、MCP-1的表达量呈正相关(r分别为0.940，0.963，0.934，0.929，均P<0.05)，说明TLR4信号通路的激活参与了DN的发生及发展过程。

肾脏局部存在独立的RAS系统，可通过调节肾脏血流动力学和其他机制参加肾脏疾病的发病过程，体外细胞培养实验发现高糖刺激下肾脏系膜细胞和肾小管上皮细胞分泌血管紧张素增加[19]。AngⅡ也可通过多种途径刺激NF-κB活化入核，从而启动炎症反应[20]，上调IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，导致肾脏的炎症过程。说明RAS系统在DN发病过程中除了发挥调节血流动力学作用外，还发挥非血流动力学作用，引起炎症因子增加，启动炎症反应。研究表明体外培养的肾小球系膜细胞在AngⅡ刺激下可诱导TLR4表达上调[21]，可能与AngⅡ导致的血流动力学改变及细胞组织损伤从而产生多种TLR4的内源性配体有关，刺激TLR4表达增加，从而激活NF-κB引起下游炎症因子表达增加。此外，AngⅡ可激活单核巨噬细胞和非免疫细胞，这些细胞激活后均可活化TLR4及其相关配体，从而介导炎症反应，引起肾脏损伤[22]。在DN治疗方面，应用ACEI和ARB在临床上能减少早期DN患者的蛋白尿，延缓肾小管间质纤维化和肾小球硬化。这种作用除了能降低血压，改变肾小球血流动力学效应外，还可能发挥了阻断TLR4信号通路的非血流动力学作用，减轻了非感染状态下的炎症反应，从而保护肾功能。本研究ARB组和DN组患者血糖、血压控制无差异(均P>0.05)，但研究结果显示ARB组患者血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量均低于DN组(均P<0.05)，ARB组TLR4、MyD88、NF-κB、MCP-1、TNF-α表达均低于DN组(均P<0.05)，进一步说明了RAS激活能活化TLR4信号通路，引起肾功能损害，使用ARB能削弱TLR4信号，并减轻肾功能损害程度，而此作用是独立于降血压作用之外的。但ARB组患者TLR4及相关炎症因子仍较C组高(均P<0.05)，并未降到正常水平，可能与ARB组患者血糖、血脂较C组较高的缘故，但在临床上即使使用ACEI、ARB阻断RAS,严格控制血糖、血压、血脂，DN最终仍难免发展为终末期肾脏病，故DN患者体内可能存在其他影响TLR4信号通路的因素。因此，可以进一步以TLR4为研究靶点，使用特异性TLR4阻断剂，观察TLR4通路变化及DN患者肾功能变化及转归情况，进一步明确DN患者体内炎症反应的具体机制，为临床探索新的治疗方案提供依据。

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(2016-08-25 收稿)

Expression of Toll-like Receptor 4 in Renal Tissue of Patients with Diabetic Nephropathy and Effects of Irbesartan

Zhang Li，Wang Yu，Du Guiyingetal

DivisionofNephrology，TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China

Objective To investigate the role of toll-like receptor 4(TLR4)signaling in patients of diabetic nephropathy(DN)and the effects of angiotension receptor blocker(ARB)on the expression of TLR4，revealing novel mechanism of inflammatory response in DN and to explore non-hemodynamic effects of ARB on renal protection.Methods Diabetic nephropathy patients were enrolled from Division of Nephrology of the First Affiliated Hospital of Nanchang University from July 2012 to June 2014.The patients treated with ARB served as irbesartan group，patients who did not use irbesartan were designated to DN group.The patients with renal resection from Urology Department served as control group(C group).Blood serum creatinine(SCr)，urea nitrogen(BUN)and 24 h total protein of urine were measured.Pathological routine staining and special staining were used to observe kidney pathological changes of each group patients.The expression of TLR4 and the related inflammation factors were detected by immunohistochemistry.Results The pathological biopsy results showed that in C group，renal glomerular and tubular mesenchyme was not changed obviously；while in DN group，the glomerular capillary basement membrane was diffusely thickened，mesangial matrix was hyperplastic and even some were severely hyperplastic to form tuberous sclerosis.Compared with DN group，the glomerular basement membrane in ARB group was mildly thickened，mesangial was hyperplastic，renal mesenchyme and small artery had no obvious pathological changes.Blood Scr，BUN，and urine protein in the DN group was higher than those in the ARB group and C group(allP<0.05).The results of immunohistochemistry showed that the levels of TLR4，MyD88，NF-B，MCP-1，TNF-α of DN group were higher than those of ARB group and C group(allP<0.05)，and those were higher in the ARB group than in C group(allP<0.05).The expression level of TLR4 was positively correlated with the levels of MyD88 and NF-B(r=0.940，0.963，P<0.05)，and also positively correlated with the levels of MCP-1 and TNF-α(r=0.934，0.929，P<0.05).Conclusion TLR4 signaling pathway is activated in DN patients and irbesartan can block the TLR4 signaling and alleviate impairment of renal function in DN patients，indicating that blocking the TLR4 signaling pathway may be a new target for the treatment of DN.

diabetic nephropathy； angiotension receptor blocker； toll-like receptor 4； inflammation factors

*国家自然科学基金资助项目(No.81060063，No.81100649，No.81660129)；江西省青年科学基金资助项目(No.20132BAB215004)

张 莉，女，1980年生，主治医师，硕士研究生，E-mail：zlilyhxh@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：lvjinlei97@163.com

R692.3

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.009