JAK2/STAT3信号通路在依达拉奉减轻大鼠小胶质细胞缺血再灌注损伤中的作用

黄丁丁+翁浩+刘荣+徐志勇+刘海健

[摘要] 目的 评价Janus激酶2/信号转导子和转录激活子3（JAK2/STAT3）信号通路在依达拉奉抑制大鼠小胶质细胞缺血再灌注损伤后脑损伤中的作用。 方法 体外培养SD乳鼠小胶质细胞，采用随机数字表法分为常规培养组（C组）、糖氧剥夺组（OGD组）、依达拉奉组（EDA组）。OGD组小胶质细胞糖氧剥夺6 h，再灌注12 h建立缺血再灌注损伤模型；EDA组细胞糖氧剥夺后加入含EDA（浓度50 μmol/L）的正常培养基后处理12 h。采用CCK8法检测细胞存活率的变化；Western blot法检测JAK2蛋白磷酸化（p-JAK2）、STAT3蛋白磷酸化（p-STAT3）变化；ELISA法检测IL-1β和IL-6的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率。 结果 与C组比较，OGD组细胞存活率降低，p-JIK2和p-STAT3的表达上调，细胞上清液中IL-1β和IL-6浓度增加，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；与OGD组比较，EDA组细胞存活率增加，p-JAK2和p-STAT3表达下调，细胞上清液的IL-1β和IL-6浓度减少，细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 依达拉奉后处理抑制大鼠小胶质细胞缺血再灌注损伤后炎性反应和细胞凋亡与JAK2/STAT3信号通路部分相关。

[关键词] 依达拉奉；小胶质细胞；STAT3转录因子；脑损伤

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0016-04

依达拉奉是氧自由基清除剂之一，可以减轻脑缺血再灌注的损伤，改善临床预后[1-4]。蛋白质酪氨酸激酶2/信号转导与转录激活因子3（JAK2/STAT3）信号通路是通过可溶性信号分子激活，参与细胞免疫调节、细胞凋亡等生物学过程[5]。动物整体水平研究表明，依达拉奉通过可以调节JAK2/STAT3信号通路减轻脑缺血再灌注损伤后半暗带区炎性反应，减少神经细胞凋亡[6]。而小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫调节细胞，对中枢神经系统炎性反应起着重要作用。本研究拟观察依达拉奉是否通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制小胶质细胞缺血再灌注损伤后的炎性反应和细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂

实验动物是出生24 h内SD乳鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号：2007000582928。DMEM培养基购自Gibco公司，依达拉奉由南京先声东元制药有限公司生产（生产批号：80160306），CCK-8试剂盒购自Sigma公司，Anti-CD11b/c购自Abcam公司，抗体p-JAK2购自Santa Cruz公司，抗体p-STAT3购自Cell Signaling公司，ELISA试剂盒购自Sigma公司。本研究动物试验经实验动物伦理委员会批准。

1.2 方法

参照文献[7]的方法培养原代小胶质细胞，主要步骤如下：在严格无菌的条件下取新生乳鼠，断头，取脑，剪碎脑组织，用胰酶消化，离心后制成细胞悬液，接种入细胞培养瓶，置于恒温培养箱培养，细胞培养14 d左右，倒掉培养液，用胰酶消化，将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入离心管，离心后接种于细胞培养板继續培养，10 min后弃掉不贴壁细胞，继续培养。采用温和消化法[8]分离纯化小胶质细胞，用流式细胞仪检测小胶质细胞纯度。

1.3 实验分组

取纯化的小胶质细接种于培养板，采用随机数字表法将其分为三组：正常对照组（C组）、糖氧剥夺组（OGD组）和依达拉奉组（EDA组）。C组正常培养12 h。OGD组换成不含糖的DMEM培养基并置于5%CO2、1%O2、94%N2培养箱孵育6 h[9]，糖氧剥夺后换成正常培养基并置于正常环境下细胞培养箱继续培养12 h用于实验。EDA组在糖氧剥夺后将培养基换成含依达拉奉（50 μmol/L）的正常培养基继续培养12 h用于实验。

1.4 指标观察

1.4.1 细胞存活率检测 采用CCK8法对各组细胞进行活力检测，用多功能酶标仪测定各孔在450 nm处吸光度，计算细胞存活率（%）=（加药组吸光值-空白对照组吸光值）/（不加药组吸光值-空白对照组）×100%。

1.4.2 小胶质细胞p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白水平检测 采用蛋白质免疫印迹分析（Western blot）。参照细胞质蛋白提取方法，将各组细胞离心收集后，经裂解高速离心，吸取上清液并加入上样缓存液混匀后，煮沸8 min，按照试剂盒操作要求，行聚丙酰胺凝胶电泳转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉室温下封闭1 h，然后加入一抗p-JAK2和p-STAT3，4℃孵育过夜，然后加入二抗孵育，使用增强化学发光法显色，采用凝胶分析软件进行分析，以目的蛋白条光密度值与内参条带光密度值的比值反应目的蛋白表达水平。

1.4.3 IL-1β和IL-6水平检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定小胶质细胞培养上清液IL-1β和IL-6水平。实验操按照说明书流程操作，每组取10个培养孔收集小胶质细胞上清液，使用多功能酶标仪检测IL-1β和IL-6浓度。

1.4.4 细胞凋亡率检测 各组小胶质细胞培养结束后，使用流式细胞仪采用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测方法检测小胶质细胞凋亡率，按照试剂盒说明操作。

1.5 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小胶质细胞的鉴定

经CD11b/c抗体处理后上流式细胞仪检测小胶质细胞纯度，同型阴性对照CD11b/c阳性细胞数占3.26%（图1A），CD11b/c抗体标记后阳性细胞数为79.08%。

2.3 三组小胶质细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白水平比较

与C组比较，OGD组细胞p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白表达增强（P < 0.05）；与OGD组比较，EDA组细胞p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白表达减弱（P < 0.05）。

3 讨论

本实使用CCK8检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞纯度，结果表明细胞活性正常，小胶质细胞纯度达到细胞实验要求。本课题组参照前期研究结果[10-11]，使用CCK-8试剂盒计算依达拉奉后处理在糖氧剥夺下对小胶质细胞的半数抑制浓度（IC50）为119.9 μmol/L，因此本实验选择依达拉奉IC50的1/3～1/2即50 μmol/L作为实验浓度。

本研究结果表明，依达拉奉后处理给药可以增加小胶质细胞缺血再灌注损伤后细胞存活率，抑制p-JAK2和p-STAT3蛋白表达，降低炎症介质IL-1β、IL-6水平，减少小胶质细胞凋亡，推测依达拉奉抑制脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞炎性反应和神经细胞凋亡与JAK2/STAT3信号通路相关。

谢慧芳等[12]的研究结果表明，依达拉奉可以抑制大鼠局灶性缺血再灌注损伤后半暗带区JAK2和STAT3蛋白磷酸化表达，减轻炎性反应，减少神经细胞凋亡，改善大鼠的神经功能的缺失。有研究结果表明，JAK2/STAT3信号传导通路参与了大鼠小胶质细胞的炎性反应和细胞凋亡，抑制JAK2/STAT3信号传导通路可以减轻氧化应激反应，抑制小胶质细胞的炎性反应，减轻了细胞凋亡[13-20]。推测依达拉奉通过减少小胶质细胞缺血再灌注后氧自由基释放，减轻氧化应激反应，减少IL-1β和IL-6大量释放，进而抑制了IL-1β和IL-6引起的一系列炎性反应引发的细胞凋亡，且JAK2/STAT3信号传导通路参与了上述依达拉奉的神经保护过程。因此，通过调节小胶质细胞内JAK2/STAT3信号传导通路可能在减轻全脑缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。

综上所述，JAK2/STAT3信号通路参与了依达拉奉后处理抑制大鼠小胶质细胞缺血再灌注损伤后炎性反应和细胞凋亡的过程。

[参考文献]

[1] Nakamoto H，Aihara Y，Yamaguchi K，et al. Efficacy，safety，and outcomes in 17 pediatric cases treated with the free radical scavenger edaravone [J]. Childs Nerv Syst，2015， 31（9）：1533-1540.

[2] Qin T，Lei LY，Li N，et al. Edaravone improves survival and neurological outcomes after cardiopulmonary resuscitation in a ventricular fibrillation model of rats [J]. Am J Emerg Med，2016，16（3）：30334-30335.

[3] Sun YY，Li Y，Wali B，et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury：implications for perioperative neuroprotection [J]. Stroke，2015， 46（7）：1947-1955.

[4] 張自豪，裴凌.依达拉奉对内毒素休克大鼠海马细胞凋亡的影响[J].中华麻醉学杂志，2015，35（7）：861-865.

[5] Dong W，Xian Y，Yuan W，et al. Catalpol stimulates VEGF production via the JAK2/STAT3 pathway to improve angiogenesis in rats' stroke modes [J]. J Ethnopharmacol，2016，15（191）：169-179.

[6] 赵彬，王玉芳，陈桂华，等.依达拉奉对脑山血大鼠血肿周围组织NF-κB p65蛋白表达的影响[J].中国医药导报，2014，11 （15）：17-19.

[7] 张思思，蔡江晖，万敬员，等.羟基积雪草苷对LPS诱导小胶质细胞增殖的抑制作用及机制研究[J].中国病理生理学杂志，2015，31（3）：428-434.

[8] 王宝萍，李东风，徐书雯.原代小胶质细胞及神经元培养不同纯化方法的比较[J].广东医学，2012，33（6）：723-725.

[9] 彭晴霞，杨碧莹，潘经锐，等.氧葡萄糖剥夺-再恢复后抑制小胶质细胞TLR9激活对神经元的保护作用[J].中国病理生理杂志，2015，31（3）：403-408.

[10] 黄丁丁，王迪芬，周晓峰，等.不同浓度依达拉奉预处理对新生大鼠脑片谷氨酸损伤的保护作用[J].贵阳医学院学报，2012，37（2）：120-126.

[11] 周晓峰，黄丁丁，王迪芬，等.丙泊酚预处理对谷氨酸损伤大鼠脑组织的保护作用研究[J].中国危重病急救医学，2012，24（12）：750-753.

[12] 谢惠芳，徐如祥，魏继鹏，等.依达拉奉对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后JAK2/STAT3信号通路的影响[J].广东医学，2007，28（7）：1043-1045.

[13] Zeng KW，Yu Q，Liao LX，et al. Anti-Neuroinflammatory Effect of MC13，a Novel Coumarin Compound From Condiment Murraya，Through Inhibiting Lipopolysaccha？鄄ride-Induced TRAF6-TAK1-NF-κB，P38/ERK MAPKS and Jak2-Stat1/Stat3 Pathways [J]. J Cell Biochem，2015， 11 6（7）：1286-1299.

[14] Song F，Zeng K，Liao L，et al. Schizandrin A Inhibits Microglia-Mediated Neuroninflammation through Inhibi？鄄ting TRAF6-NF-κB and Jak2-Stat3 Signaling Pathways [J]. Plos One，2016，11（2）：e0149991.

[15] Mao J，Yang J，Zhang Y，et al. Arsenic trioxide mediates HAPI microglia inflammatory response and subsequent neuron apoptosis through p38/JNK MAPK/STAT3 pathway [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2016，15 （303）：79-89.

[16] 赵博，冷燕，吴晓静，等.JAK2/STAT3信号通路在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注诱发脑损伤中的作用[J].中華麻醉学杂志，2016，36 （2）：211-214.

[17] 陈真珍，王凯华，黄龙坚，等.JAK2/STAT3信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用[J].中国实用神经疾病杂志，2013，16 （10）：29-31.

[18] Qin H，Buckley JA，Li X，et al. Inhibition of the JAK/STAT Pathway Protects Against α-Synuclein-Induced Neuroin？鄄flammation and Dopaminergic Neurodegeneration [J]. J Neur？鄄osci，2016，36 （18）：5144-5159.

[19] O′Callaghan JP，Kelly KA，VanGilder RL，et al. Early Activation of STAT3 Regulates Reactive Astrogliosis Induced by Diverse Forms of Neurotoxicity [J]. Plos One，2014，9 （7）：e102003.

[20] Lu Y，He M，Xu S，et al. Differential pro-inflammatory responses of astrocytes and microglia involes STAT3 activation in response to 1800MHz radiofrequency fields [J]. Plos One，2014，9（9）：e108318.

（收稿日期：2016-08-04 本文编辑：程 铭）