土槿皮乙酸抗人宫颈癌Siha细胞及其机制研究

付琼++李文霞++殷金凤+++潘敏

[摘要] 目的 探讨土槿皮乙酸（PAB）对人宫颈鳞癌Siha细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用及其相关机制。 方法 根据不同PAB浓度和作用时间，将Siha细胞分为对照组（0 μmol/L）及1、2、4、8、16 μmol/L PAB组和24、48、72 h组。采用CCK-8试剂盒检测不同浓度（0、1、2、4、8、16 μmol/L）PAB作用不同时间（24、48、72 h）后对Siha细胞的增殖抑制率。采用免疫印迹法检测不同浓度PAB（0、2、4、8 μmol/L）作用48 h后Siha细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达变化。 结果 1、2、4、8、16 μmol/L PAB对Siha细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量-时间依赖效应关系。与0 μmol/L PAB对照组比较，2、4、8 μmol/L PAB组Siha细胞PI3K、p-Akt、p-GSK-3β和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达明显下调，促凋亡蛋白Bax表达明显增加（P < 0.05）。 结论 PAB具有抗人宫颈鳞癌Siha细胞作用，且可能与PI3K/Akt/GSK-3β信号通路抑制及上调Bax和下调Bcl-2表达有关。

[关键词] 土槿皮乙酸；宫颈癌；增殖；凋亡

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0029-04

Study on the inhibition effect of pseudolaric acid B in human cervical carcinoma cell line Siha and its mechanism

FU Qiong LI Wenxia YIN Jinfeng PAN Min

Department of Gynecology and Obstetrics， Chengdu Second People's Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610017， China

[Abstract] Objective To explore the effect of pseudolaric acid B （PAB） on human cervical carcinoma cell line Siha and its mechanism. Methods Siha cells were divided into control group （0 μmol/L PAB） and 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L PAB group according to the concentrations of PAB， and 24， 48， 72 h group according to the treating time of PAB. The inhibitory effect of different concentrations of PAB （0， 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L） and different exposure time （24， 48， 72 h） on Siha cells were measured by CCK-8 essay. The protein expression levels of PI3K， Akt， p-Akt， GSK-3β， p-GSK-3β， Bax and Bcl-2 were detected by immunoblotting. Results 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L PAB had remarkable inhibiting effects on Siha cells and in a dose- and time-dependent manner. The protein expression levels of PI3K， p-Akt， p-GSK-3β and Bcl-2 were decreased in 2， 4， 8 μmol/L group of Siha cells than 0 μmol/L group after 48 exposure （all P < 0.05）. On the contrary， the protein expression level of Bax was increased （P < 0.05）. Conclusion PAB can inhibit the proliferation of Siha cells， its mechanism may be related to the inhibition of PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway and the up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2.

土槿皮為松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮，土槿皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）是从土槿皮中提取分离得到的新型二萜酸化合物。有研究表明PAB具有抗真菌[1]、抗肿瘤[2-5]、抗血管生成[6-7]、激活过氧化物酶体增生物激活受体[8]等药理作用。宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家尤为常见，是妇科三大恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的健康[9]。因此，研究药物对人宫颈癌细胞作用的分子机制，对宫颈癌的治疗和预防具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备

PAB购于成都瑞芬思生物科技公司（规格：500 mg，批号：20160412）；RPMI1640培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）购于上海吉诺生物科技公司；胎牛血清购于杭州四季青生物公司（批号：160413）；CCK-8试剂盒（批号：20160318）、BCA试剂盒（批号：20160317）购于武汉科瑞生物科技公司；RAPI裂解液（批号：20160317）、抗β-actin（货号：GB13001-3）一抗购于武汉谷歌生物公司；抗PI3K（货号：4257）、Akt（货号：9272）、p-Akt（货号：4060）、GSK-3β（货号：9315）、p-GSK-3β（货号：9322）、Bax（货号：5023）和Bcl-2（货号：3498）一抗购于美国CST公司；羊抗兔荧光二抗（货号：C40109-04）购于美国LI-COR公司。CO2培养箱为德国BINDER公司产品（BD53型）；倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品（CKX31型）；酶标仪为美国PerkinElmer公司产品（1420型）；电泳电转仪为北京六一仪器厂产品（DYCZ-40D型）；双色红外激光成像系统为美国LI-COR公司产品（Odyssey）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人宫颈鳞癌Siha细胞购于中国典型培养物保藏中心，培养于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL），于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞增殖抑制率检测 Siha细胞以5×103/孔种于96孔板，24 h后更换含不同浓度PAB的培养基100 μL。药物浓度分别为0、1、2、4、8、16 μmol/L，每个浓度设6个副孔，分别于24、48、72 h更换CCK-8检测试剂100 μL（90 μL RMPI1640培养基+10 μL CCK-8液），于5%CO2、37℃恒温培养箱中孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长检测各孔的吸光度值（A）。实验重复3次。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。

1.2.3 免疫印迹实验 A2780细胞以2×105/孔种于6孔板，24 h后更换含不同浓度PAB的培养基1.5 mL，药物浓度分别为0（对照组）、2、4、8 μmol/L，48 h后吸出培养基，预冷PBS洗1遍，向每孔细胞中加入预冷的RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）200 μL，冰上静置5 min后用细胞刮刮下细胞转入无菌EP管中，冰上裂解30 min。12 000g低温离心5 min，取上清，每个样本取20 μL上清用BCA法测定蛋白样品浓度，剩余蛋白上清加入上样缓冲液充分混匀后100℃水浴加热10 min。每孔20 μg蛋白体系，行10% SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜；3%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（PI3K 1∶1000、Akt 1∶1000、p-Akt 1∶2000、GSK-3β 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-actin 1∶2000）4℃搖床孵育过夜；洗膜后加入荧光山羊抗兔二抗（1∶10 000）室温摇床孵育1 h，洗膜后于双色红外激光成像系统扫描收集荧光信号。以β-actin为内参照，采用QuantityOne-v4.6.2软件对Western条带进行定量分析，蛋白条带与内参的灰度比值为相对表达水平。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各实验组与对照组间的两两比较采用Dunnett法，实验组之间的两两比较采用SNK法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度PAB作用不同时间后对Siha细胞增殖抑制率的影响

与对照组比较，1、2、4、8、16 μmol/L PAB处理Siha细胞24、48、72 h后，细胞增殖受到明显抑制，且与药物作用时间和药物浓度呈正相关，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 PAB对Siha细胞PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响

与对照组比较，2、4、8 μmol/LPAB作用48 h后，PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达减少（P < 0.05），而Akt和GSK-3β蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。此外，与2 μmol/L组比较，4 μmol/L组细胞PI3K和p-GSK3β蛋白表达降低（P < 0.05），同时，与4 μmol/L组比较，8 μmol/L组细胞PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达下调（P < 0.05）。因此，PAB能下调PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达，且呈现一定的剂量依赖性。见图1。

2.3 PAB对Siha细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响

与对照组比较，2、4、8 μmol/LPAB处理组细胞促凋亡蛋白Bax表达增加（P < 0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调（P < 0.05）。此外，与4 μmol/L组比较，8 μmol/L组细胞Bax蛋白表达减少，且4 μmol/L组和8 μmol/L组细胞Bcl-2蛋白表达分别较2 μmol/L组和4 μmol/L组减少（P < 0.05）。因此PAB可上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，且呈现一定的剂量依赖性。见图2。

3 讨论

宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，占女性生殖系统恶性肿瘤的半数以上，严重威胁女性的健康[10]。PAB是从土槿皮中提取分离得到的新型二萜酸化合物。研究表明PAB对于多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用[2-5]。本实验用PAB体外实验研究观察该药对Siha细胞的抑制作用。结果表明，PAB在1～16 μmol/L浓度范围内对Siha细胞的增殖均有抑制作用，并呈现明显的剂量和时间依赖效应关系，表明该药对宫颈癌有治疗潜能。

研究表明，磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3-kinese/protein kinase B，PI3K/Akt）通路与肿瘤的发生发展、转移、治疗耐药性密切相关[11]，细胞在一系列内外因素的作用下，通过PI3K/Akt信号转导通路，诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡[12]。GSK3是一种可以调控多种细胞功能的关键酶[13]，是调节糖原合成的关键激酶，磷酸化糖原合酶并使之失活，从而抑制糖原合成促进糖代谢[14]，同时参与到多种信号通路的调节[14-16]。研究[17-18]表明GSK3的激活在多种情况下参与到细胞凋亡过程。Saiprasad等[19]研究表明GSK-3β参与到PI3K/AKT介导的细胞凋亡过程。本研究为了研究PI3K/AKT/GSK-3β在PAB诱导宫颈癌Siha细胞凋亡中的作用，采用不同浓度的PAB处理Siha细胞，结果表明，在2、4、8 μmol/LPAB作用48 h后，PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达明显减少，而Akt和GSK-3β蛋白表达无变化，说明PAB可抑制Siha细胞PI3K/AKT/GSK-3β信号通路。

Bcl-2家族成员在肿瘤细胞凋亡中也发挥重要作用[20]。Bax活化后引起细胞色素C释放到胞浆中并与apaf-1结合激活Caspase-9，然后激活下游的Caspase-3等。在不同浓度PAB对诱导的Siha细胞凋亡中，本研究发现2、4、8 μmol/LPAB处理组Siha细胞促凋亡蛋白Bax表达明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下调，且呈现一定的剂量依赖性，表明PAB通过增加Bax/Bcl-2的比例，激活以线粒体为中心的信号转导途径而诱导细胞凋亡。

综上所述，PAB为一种具有潜在抗人宫颈癌作用的中药活性成分，可通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路来抑制细胞的增殖，并通过促进促凋亡蛋白Bax的表达和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来促进宫颈癌细胞的凋亡，为临床应用PAB治疗宫颈癌提供了有力的实验证据和理论依据，为新药的研发开辟了新领域。

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（收稿日期：2016-08-04 本文編辑：张瑜杰）