补骨脂乙醇提取物小鼠灌胃急性及亚急性毒性试验研究

阿卜杜米吉提·阿卜力孜+阿布都吉力力·阿布都艾尼+艾西木江·热甫卡提+尤力都孜·买买提+李治建+斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 研究补骨脂乙醇提取物（EEPF）的急性毒性特点。 方法 急性毒性分对照组和EEPF组[12.0 g/（kg·d）]，灌胃给药，亚急性毒性分对照组和EEPF 0.65、1.30 g/kg组，灌胃给药14 d，进行一般观察，检测体重、脏器重量及系数、血液学及血液生化学，并进行肝脏、肾脏组织病理学检查。 结果 急性毒性小鼠死亡14只，可见肝脏中央静脉扩张充血，部分肾小管扩张；亚急性毒性给药14 d未见明显反应，EEPF低剂量组雄性脾脏重量及系数明显降低、雌性胸腺重量及系数明显升高（P < 0.05），雌性高剂量组体重明显升高（P < 0.05）、肾脏系数显著降低（P < 0.01）；血液学：EEPF组雄性中性粒细胞计数（NEUT）比例（%）、单核细胞（MONO）比例（%）明显降低（P < 0.05），红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血细胞比容（HCT）（%）、淋巴细胞（LYMPH）（%）明显升高（P < 0.05），雌性RBC明显升高（P < 0.05），血小板计数（PLT）和血小板压积（PCT）显著升高（P < 0.01）；血液生化学：EEPF雄性低剂量组A/G显著升高（P < 0.01），尿素氮（BUN）明显升高（P < 0.05），高剂量组丙氨酸氨基转移酶（ALT）和三酰甘油（TG）显著降低（P < 0.01），雌性低、高剂量组总胆红素（TBIL）明显降低（P < 0.05），TG显著降低（P < 0.01），总胆汁酸（TBA）和ALT明显升高（P < 0.05），高剂量球蛋白（GLOB）明显降低（P < 0.05）；EEPF组出现肝细胞坏死、肾小球萎缩。 结论 EEPF最大给药量12.0 g/kg可致部分小鼠70%死亡；亚急性毒性EEPF 0.65、1.30 g/kg对小鼠血液学、血液生化学有一定影响，肝脏、肾脏可见毒性病变。

[关键词] 补骨脂乙醇提取物；小鼠；急性；亚急性；毒性

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0020-05

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，是中医、维吾尔医常用药材[1]，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻等作用，用于肾阳不足、阳痿遗精等，外用治白癜风、斑秃[2-3]。《卫生部药品标准——维吾尔药分册》收载的含补骨脂的白癜风治疗制剂有9种[4]；《中国药典》（2015年版）中收载的含补骨脂的中成药就有40种[2]，临床应用更广泛。有报道补骨脂及其复方具有肝毒性[5-11]，其安全性值得关注。如不能阐明其毒性的特点，将会限制补骨脂的推广使用。本研究对补骨脂乙醇提取物（ethanol extract of Psoraleae Fructus，EEPF）小鼠灌胃急性及亚急性毒性进行研究，探讨其毒性作用及靶器官，为其重复给药毒性研究提供相关的信息，以及临床应用急性中毒解毒提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.1.1 药品

EEPF，批号：20160310，按高效液相色谱法测定[2]，含补骨脂素5.22 mg/g、异补骨脂素3.78 mg/g和补骨脂酚231.15 mg/g。药材购自新疆齐康哈博维药有限责任公司（批号：20151027），由新疆维吾尔医药研究所希尔艾力主任药师鉴定为正品。提取方法：取药材10 kg，10倍量75%乙醇加热回流提取1 h，共3次，合并提取液浓缩干燥，出膏率为9.51%。

1.1.2 试剂

丙氨酸氨基转移酶（ALT）（批号：140215003）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）（批号：140115002）；碱性磷酸酶（ALP）（批号：140314022）；尿素氮（BUN）（批号：141315001）；肌酐（Cr）（批号：141315016）；总蛋白（TP）（批号：140815002）；白蛋白（ALB）（批号：140915013）；总胆固醇（TC）（批号：141615013）；血糖（GLU）（批号：141515012）；总胆红素（TBIL）（批号：140615012）；磷酸肌酸激酶（CK）（批号：142515012）；三酰甘油（TG）（批号：141715014）；谷氨酰转肽酶（GGT）（批号：141715032），均由深圳邁瑞生物医疗电子股份有限公司提供。血液学试剂，SYSMEX公司，批号：A2007。

1.2 动物

昆明小鼠，体重（20±2）g，购自新疆实验动物研究中心，SPF级，许可证号：SCXK（新）2011-0001。饲养于新疆维吾尔医药研究所SPF级动物房，自由饮水、摄食，室温20～26℃，湿度40%～70%，光照/黑暗12/12 h。

1.3 方法

1.3.1 EEPF急性毒性试验

1.3.1.1 分组及剂量 设对照组（0.5%CMC-Na）、EEPF [12.0 g/（kg·d）]组，每组20只，雌、雄各半。按补骨脂药材每天临床用量10 g[2]、出膏率为9.51%计算，相当于日服用提取物0.951 g，EEPF 12.0 g/（kg·d）相当于临床人（60 kg计算）每公斤体重用药量的约750倍。

1.3.1.2 给药方法 以EEPF最大配制浓度20%，每次灌胃给药0.3 mL/10 g（每次6.0 g/kg），2次/d，间隔4～5 h给药第2次，合计12.0 g/（kg·d）。进行常规指标观察。

1.3.2 EEPF亚急性毒性试验

1.3.2.1 分组及剂量 小鼠随机分组，每组20只，雌、雄各半，设对照组（Ⅰ组），EEPF 0.65 g/kg（Ⅱ组）、1.30 g/kg组（Ⅲ组），分别为临床剂量的40、80倍。

1.3.2.2 给药方法 以EEPF配制浓度3.4%（低剂量）、6.8%（高剂量），灌胃给药0.2 mL/10 g，1次/d，共14 d。

1.4 观察指标

给药前（D0）和给药第1、4、7、11、14天称取体重；末次给药后禁食过夜毛细管眼眶采血加入抗凝剂检测红细胞（RBC）、白细胞计数（WBC）、血小板（PLT）、血红蛋白（HGB）、血细胞比容（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均血红蛋白量（MCH）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、网织红细胞（Ret）。另外眼眶采血1.5 mL不加抗凝剂测定血液生化学指标。取肝脏、肾脏、胸腺、脾脏称重计算脏器系数（脏器重量/体重×100%），肝脏、肾脏于15%甲醛溶液固定，HE染色，观察组织形态变化。

1.5 统计学方法

采用PEMS统计软件进行统计，组间比较时采用单因素方差分析，方差齐时用t检验，方差不齐时用秩和检验。结果以均数±标准差（x±s）表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EEPF急性毒性试验

第1次给药后小鼠出现活动减少、呼吸急促、倦怠、竖毛等症状，无死亡；第2次给药后1 h内死亡14只，其中雄性5只、雌性9只，解剖可见肝脏充血，剩余动物24 h后恢复正常，观察14 d未见明显症状。由图1～2可见，组织病理学检查EEPF组肝脏中央静脉扩张充血，部分肾小管扩张。

2.2 EEPF亚急性毒性试验

2.2.1 一般观察

与Ⅰ组比较，亚急性毒性试验EEPF组给药14 d未见明显反应，动物无死亡。

2.2.2 体重、脏器重量级系数

与Ⅰ组比较，Ⅲ组雌性给药第4～14天体重升高，雄性未见明显改变（图3～4）；雄性低剂量组脾脏重量及系数明显降低（P < 0.05），雌性低剂量组胸腺重量及系数明显升高（P < 0.05），雌性高剂量组肾脏系数显著降低（P < 0.01）。

（n = 10）

2.2.3 血液学

与Ⅰ组比较，EEPF组雄性RBC、HGB、HCT、LYMPH明显升高（P < 0.05），MONO明显降低（P < 0.05），Ⅱ组NEUT明显降低（P < 0.05），WBC显著升高（P < 0.01）；雌性动物Ⅲ组PLT、PCT显著升高（P < 0.01），RBC明显升高（P < 0.05），其余指标与Ⅰ组比较未见明显改变，见表2～3。

2.2.4 血液生化学

与Ⅰ组比较，雄性动物Ⅲ组ALT、TG显著降低（P < 0.01），Ⅱ组A/G显著升高（P < 0.01），BUN明显升高（P < 0.05）；雌性动物EEPF组TBIL明显降低（P < 0.05），TG显著降低（P < 0.01），Ⅲ组GLOB明显降低（P < 0.05），Ⅱ组ALT、TBA明显升高（P < 0.05），其余指标与Ⅰ组比较未见明显改变，见表4～5。

2.2.5 组织病理学检查

Ⅰ组肝肾组织未见明显改变。EEPF组可肝细胞坏死、肾小球萎缩。见图5～6。

3 讨论

急性毒性EEPF可致70%动物死亡，且雌性死亡多于雄性，死亡动物肝脏中央静脉扩张充血，部分肾小管扩张。亚急性毒性试验雌性高剂量组体重明显升高，雄性体重未见明显改变，EEPF组脾脏、胸腺重量及系数与对照组比较虽有统计学差异，但均为低剂量改变，无明显剂量效应关系，考虑非药物引起。血液生化学雄性ALT的降低、雌性TBIL的降低虽有统计学差异，无毒理学意义，雌雄小鼠TG均明显降低，雌性GLOB有一定降低，判断与影响肝脏脂质代谢相关，组织病理学检查可见EEPF组肝细胞坏死、肾小球萎缩，且雌性肾脏系数有一定降低，雌性ALT、TBA升高，临床报道其肝损伤特点多为女性ALT、TBA升高，与临床表现具有相似性[6，11]，判断TG、GLOB的降低和LYMPH的升高与影响肝脏功能相关，考虑EEPF对雌性肝、肾有一定影响。

另外，EEPF可引起小鼠RBC、HGB、HCT、PCT升高，对小鼠血液学有一定影响。有文献报道补骨脂素具有提高小鼠造血功能的作用[12-13]。《中国药典》中含补骨脂的此类复方有“补肾养血丸”“再造生血片”等均作用于造血系统[14]。因此，判断EEPF对小鼠血液学的影响可能与其功能主治相关。

补骨脂要含香豆素、黄酮等化合物[15-18]。临床应用[5-6]和毒理学研究[7-9]发现补骨脂及复方对肝脏有一定的毒性作用[19-21]。韓国曾报道了与食用补骨脂有关的急性肝炎病例[5]，部分含有补骨脂的中成药亦偶见肝毒性报道[10]。2009年香港报道3例肝损害病例，患者均使用补骨脂方剂[11]。本研究可见EEPF可致肝细胞坏死、肾小球萎缩，其毒性特点、毒性成分及机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2016-07-11 本文编辑：张瑜杰）