双靶点沉默hTERT和Bi-1基因诱导人鼻咽癌细胞凋亡的初步研究

何柯新，王会敏，麦静雯，邱萍英，徐鹏，张烨梓，洪剑浩，林裕龙

（1广州医科大学附属脑科医院／广州市惠爱医院，广东 广州510370；2广州中医药大学第二附属医院／广东省中医院，广东 广州510120）

双靶点沉默hTERT和Bi-1基因诱导人鼻咽癌细胞凋亡的初步研究

何柯新1，王会敏2，麦静雯1，邱萍英1，徐鹏1，张烨梓1，洪剑浩1，林裕龙1

（1广州医科大学附属脑科医院／广州市惠爱医院，广东 广州510370；2广州中医药大学第二附属医院／广东省中医院，广东 广州510120）

目的 利用RNA干扰阻抑hTERT和Bi－1基因的表达并诱导人鼻咽癌细胞的凋亡。方法 收集CNE-2Z细胞，设未处理组、Lip组、pcDNA3.1（+）／Lip对照组、TR／Lip组、TRs／Lip组、Bi-1／Lip组、Bi-1s／Lip组、TR-Bi-1／Lip组和TRs-Bi-1s／Lip组，采用MTT法观察质粒载体及转染试剂对CNE-2Z细胞生长增殖的影响；采用流式细胞术检测CNE-2Z细胞凋亡，Hoechst 33258染色，采用荧光显微镜观察鼻咽癌细胞形态学的变化。结果 TR、Bi-1和TR-Bi-1组的CNE-2Z细胞增殖能力显著降低，且TR-Bi-1组的生长增殖能力最低 （P<0.05）；凋亡细胞有所增加。转染TR、Bi-1和TR-Bi-1重组质粒48 h后，荧光显微镜下可见部分鼻咽癌细胞出现典型的凋亡形态学变化；而pcDNA3.1（+）、TRs、TRs-Bi-1s、Lip和未处理组则无明显变化。结论 双基因表达载体可以同时特异、有效地沉默hTERT和Bi－1两种基因，与沉默单基因的效果相比较，双基因沉默组鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖率受到明显抑制。

RNA干扰；鼻咽癌；hTERT；Bi-1

鼻咽癌 （nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国华南地区的高发性恶性肿瘤疾病，研究［1-2］表明其发病除了与EB病毒感染、化学致癌物有关之外，与遗传易感基因也有密切的关系。近年来，RNA干扰 （RNA interference，RNAi）的研究进展非常迅速，本课题将前期研究［3］已构建的靶向人类端粒酶末端逆转录酶（human telomerase reverse transcriplase，hTERT）和Bax inhibitor－1（Bi－1）的siRNA双基因表达载体转染人鼻咽癌细胞株CNE－2Z，研究RNAi效应对人鼻咽癌细胞株CNE－2Z细胞凋亡诱导的作用，从而为鼻咽癌提供了新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料 仪器：TE 2000－E智能型倒置荧光显微镜购自Nikon公司；8900型全自动荧光化学发光成像仪购自美国Alpha公司；Epics－XL型流式细胞仪购自美国Coulter公司；TC 2323型CO2孵箱购自美国SHELLAB公司；752型紫外光栅分光光度计购自上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂。试剂：鼻咽癌细胞株CNE－2Z和真核细胞表达质粒pcDNA3.1（＋）由广东医学院生物化学和分子生物学研究所提供；真核细胞表达质粒系列（TR、TRs、Bi－1、Bi－1s、TR－Bi－1和TRs－Bi－1s）为自行构建；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；DMSO和PI购自Sigma公司；MTT购自Promega公司；细胞凋亡－Hoechst染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法检测细胞增殖情况 设未处理组、Lip组、pcDNA3.1（＋）／Lip对照组、TR／Lip组、TRs／Lip组 （TR／Lip组阴性对照）、Bi－1／Lip组、Bi－1s／Lip组（Bi－1／Lip组阴性对照）、TR－Bi－1／Lip组和TRs－Bi－1s／Lip组（TR－Bi－1／Lip组阴性对照）。各组的质粒为0.2 μg，Lip为0.5 μL／孔，每组设4个平行孔。转染细胞48 h后加入10 mg／mL MTT 10 μL继续培养4 h，再加入150 μL／孔的DMSO，取出后于水平摇床上轻轻震荡10 min，使紫色结晶物充分溶解，然后用酶标仪测定吸光度A570／630，结果取4个平行孔的均值，重复 3次实验。肿瘤细胞抑制率 ＝ （1－各组实验组A570／630／未处理组A570／630）×100%。

1.2.2 FCM检测含各重组质粒诱导鼻咽癌细胞凋亡情况 设未处理组、Lip对照组、pcDNA3.1（＋）／Lip组、TR／Lip组、TRs／Lip组、Bi－1／Lip组、Bi－1s／Lip组、TR－Bi－1／Lip组和TRs－Bi－1s／Lip组。转染CNE－2Z细胞48 h后，收集细胞，离心弃去培养液，用PBS洗三遍，然后加预冰冷的70%乙醇固定，漩涡震荡使细胞分散开，放入4℃冰箱过夜保存。上机前离心，弃去固定液，用PBS洗三遍以彻底去除残留的乙醇，加600 μL PI染料，室温避光放置30 min，采用流式细胞仪检测。

1.2.3 Hoechst 33258荧光染色 实验设未处理组、Lip对照组、pcDNA3.1（＋）／Lip组、TR／Lip组、TRs／Lip组、Bi－1／Lip组、Bi－1s／Lip组、TR－Bi－1／Lip组和TRs－Bi－1s／Lip组。收集转染重组质粒48 h后的细胞，PBS洗3次，加入0.5 mL固定液，4℃过夜。去除固定液，PBS洗2次，3 min／次。加入0.5 mL Hoechst 33258染色5 min，去除染色液，PBS洗2次，3 min／次。加抗荧光淬灭剂于6孔板内，紫外光激发、荧光显微镜下观察细胞核形态以区分天然细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件处理数据。计量资料以±s表示，预先用Homogeneity of Variances进行方差齐性检验，如方差齐采用LSD检验和S－N－K检验，如方差不齐采用Tamhane＇s T2检验。P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 各干扰质粒对鼻咽癌细胞株生长增殖的影响 转染相应质粒48 h后，用MTT比色法检测CNE－2Z细胞增殖抑制率，结果见表1。Lip对照组、pcDNA3.1（＋）／Lip对照组、TR－Bi－1／Lip组与未处理组比较均无统计学差异 （P>0.05）；各干扰质粒／Lip组与未处理组比较有显著统计学差异 （P<0.01），提示针对hTERT和Bi－1基因设计的siRNA序列对CNE－2Z细胞的生长增殖有一定影响。其中以 TR－Bi－1／Lip组 （双基因表达载体组）的抑制效果最好，在CNE－2Z细胞中的抑制率达到（49.00±3.75）%，这也说明了构建的双基因表达载体在抑制CNE－2Z细胞生长增殖方面具有更强的能力。

表1 Lip和各质粒对CNE-2Z细胞生长的抑制作用比较 （±s）

表1 Lip和各质粒对CNE-2Z细胞生长的抑制作用比较 （±s）

注：与未处理组比较，**P＜0.01。

组别 n A570／630 增长率（%） 抑制率（%）Lip组 4 1.87±0.04 97.72±2.44 2.28±2.44 pcDNA3.1（＋）／Lip组 4 1.87±0.07 96.84±3.61 3.16±3.61 TR／Lip组 4 1.14±0.14 59.11±7.14 40.89±7.14**TRs／Lip组 4 1.88±0.10 97.35±5.14 2.65±5.14 Bi－1／Lip组 4 1.23±0.16 63.88±8.13 36.12±8.13**Bi－1s／Lip组 4 1.87±0.23 96.78±12.00 3.22±12.00 TR－Bi－1／Lip组 4 0.98±0.07 51.00±3.75 49.00±3.75**TRs－Bi－1s／Lip组 4 1.89±0.14 97.89±7.15 2.11±7.15 4 1.93±0.29 100.03±6.93 －未处理组

2.2 各重组质粒诱导鼻咽癌细胞的凋亡 PI为定量细胞化学荧光染料，能插入双链DNA和RNA的碱基对之间；每隔5个碱基插入一个PI分子。经RNA酶消化后与DNA特异结合，以特定波长 （340 nm）激发，可发射红色荧光（620 nm）。核酸分子越大，则插入的PI分子越多，荧光强度越大。流式细胞术分析就是根据这一原理，计数一定量的个体（细胞或凋亡小体），根据荧光强度推断核酸分子大小。因此可了解细胞DNA含量变化及分布。凋亡细胞经PI染色后，流式细胞仪检测到G1期前出现亚二倍体峰，此峰为凋亡峰，其峰值的高低代表凋亡细胞数量的多少。转染CNE－2Z细胞48 h后，TR／Lip组、Bi－1／Lip组、TR－Bi－1／Lip组均可见细胞凋亡，凋亡率分别达到（13.5± 2.5）%、 （8.6±2.9）%和（17.3±2.1）%，而未处理组、Lip组和pcDNA3.1（＋）／Lip组、TRs／Lip组、Bi－1s／Lip组和TRs－Bi－1s／Lip组几乎无凋亡峰出现，见图1。

图1 各重组质粒作用CNE-2Z细胞48h后细胞凋亡情况

2.3 Hoechst 33258荧光染色结果 Hoechst 33258能特异地与双链DNA中富含AT的区域结合，因此能将细胞的胞核染色，在355 nm激发光下发出蓝色荧光。经Hoechst 33258染色后，荧光显微镜下可见对照组细胞的染色质密度均匀一致，呈弥散均匀的荧光。而转染重组质粒后，较多细胞表现出典型的细胞凋亡特征性变化：荧光增强，胞核缩小碎裂，呈大小不等的不规则块状、圆形或花瓣状的细胞碎片，结果见图2。在CNE－2Z细胞中，与未处理组、Lip组、pcDNA3.1（＋）／Lip组及乱码／Lip组细胞形态比较，TR／Lip组、Bi－1／Lip组和TR－Bi－1／Lip组在转染48h后出现较为典型的凋亡形态学改变。

图2 各重组质粒作用CNE-2Z细胞48h后的形态学改变（200×）

3 讨论

基因治疗作为21世纪基因组学的一个重要发展方向，正在不断发展和完善。随着人类基因组详细图谱的问世，新的治疗基因不断被发现，因此对靶基因的选择将更加广泛。

Cioca等［4］在运用RNAi技术诱导白血病细胞 （分别选用HL－60、THP－1、U937和K562细胞株）凋亡时，以c－raf和bcl－2基因为靶基因，结果发现单沉默c－raf基因只能阻止单核白血病细胞分化，而同时沉默 c－raf和bcl－2基因，不但诱导了HL－60、THP－1、U937白血病细胞株发生凋亡，而且还增加了这些癌细胞对抗癌药物的敏感性。近年来，应用RNAi技术靶向hTERT、LMP－1、bcl－xL基因对鼻咽癌进行基因治疗取得了一定成果［5－8］，表明运用RNAi技术阻抑某些癌基因表达在诱导某些癌细胞凋亡、抑制其复发和远处转移具有一定意义。研究［9－12］表明，鼻咽癌细胞中的确存在多个癌基因的异常表达，如bcl－2、survivin、bcl－xL、cyclinD1、ras和c－myc等的过度表达，因此只针对个别基因进行基因治疗不可能彻底治愈肿瘤。本课题组近年来一直从事鼻咽癌研究［5,8］：分别靶向转染bcl－xL和hTERT基因的干扰质粒能阻抑抗凋亡蛋白bcl－xL和hTERT的表达，有效引起鼻咽癌细胞株CNE－2Z生长和增殖减缓，并可诱导部分鼻咽癌细胞凋亡。因此，将pcDNA3.1（＋）系列重组质粒转染到鼻咽癌细胞株CNE－2Z中，在细胞中经转录形成shRNA，期望可诱导鼻咽癌细胞发生凋亡。

MTT实验表明，TR－Bi－1／Lip组与TR／Lip组、Bi－1／Lip组均都可抑制CNE－2Z细胞的增殖，但由于TR－Bi－1／Lip组同时沉默了hTERT和Bi－1两种癌基因，所以抑制CNE－2Z细胞增殖的能力更强。流式细胞仪检测CNE－2Z细胞凋亡实验中，TR－Bi－1／Lip组的凋亡峰最高，凋亡细胞数也最多，这与MTT的结果相一致。在细胞形态学方面，CNE－2Z细胞经Hoechst 33258染色后，荧光显微镜下观察到，TR－Bi－1／Lip组、TR／Lip组和Bi－1／Lip组三组中的细胞都呈现出凋亡的形态，而TR－Bi－1／Lip组中细胞凋亡形态更明显，数量也更多。

本研究所构建的双基因表达载体在两种基因互不产生拮抗作用的前提下能同时沉默两个基因，与未处理组和对照组相比，所诱导的细胞增殖得到最大的抑制效果，凋亡细胞数也明显增多，也证实了同时沉默多个基因的方案是可行的。因此在今后的研究工作中，运用RNAi技术同时沉默鼻咽癌细胞中多个不同的凋亡抑制因子，以期通过不同的凋亡途径共同诱导鼻咽癌细胞发生凋亡，增加诱导鼻咽癌细胞发生凋亡的比例，使鼻咽癌的基因治疗具有更加光明的前景。

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（责任编辑：常海庆）

Preliminary Study on Apoptosis of Human Nasopharyngeal Carcinoma Cells Induced by Dual Targeted Silencing GeneshTERT and Bi-1

HE Kexin1,WANG Huimin2,MAI Jingwen1,QIU Pingying1,XU Peng1,ZHANG Yezi1,HONG Jianhao1,LIN Yulong1(1The Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University/Guangzhou Huiai Hospital,Guangzhou 510370,China;2The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine/Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510120,China)

ObjectiveTo explore RNA interference inhibiting hTERT and Bi-1 gene expressions and inducing the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsCNE-2Z cells were collected and divided into untreated group,Lip group,pcDNA3.1(+) /Lip group,TR/Lip group,TRs/Lip group,Bi-1/Lip group,Bi-1s/Lip group,TR-Bi-1/Lip group and TRs-Bi-1s/Lip group.MTT assay was applied to observe plasmid vectors and proliferation of CNE-2Z cells affected by the transfection.Flow cytometry(FCM)was used to detect the apoptosis of CNE-2Z cells.The apoptosis and morphologic changes of CNE-2Z cells with Hoechst 33258 staining were analyzed with fluorescence microscope.ResultsThe proliferation significantly decreased in TR,Bi-1 and TR-Bi-1 groups,and was lowest in TR-Bi-1 group(P＜0.05).The apoptotic cells increased.After 48-hour transfection for TR,Bi-1 and TR-Bi-1 recombinant plasmids,the typical morphological apoptosis changes of some nasopharyngeal carcinoma cells were found with fluorescence microscope,but not in pcDNA3.1 (+),TRs,TRs-Bi-1s,Lip and untreated group.ConclusionsDual-gene coexpression vectors can inhibit the expressions of hTERT and Bi-1 genes specifically and effectively.Dual-gene silence groups inhibit the proliferation of CNE-2Z cells more significantly than single-gene silence group.

RNA interference;Nasopharyngeal carcinoma;hTERT;Bi-1

R739.6

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.01.0023

2016－08－12

2016－10－11

广东省中医药局科研项目 “绿茶提取物靶向HIF-α的抗阿尔茨海默病Aβ生成及其机制的研究” （项目编号：20161092）

何柯新 （1982－），男，硕士研究生学历，主管技师，研究方向：临床生物化学与生物化学检验。