硫化氢通过调控转化生长因子-β及基质金属蛋白酶-9/基质金属蛋白酶抑制剂-1改善糖尿病大鼠肾小管间质纤维化

李子宁 梁 彪 刘茂军 褚 春 曾 欧 李 琳 李 妍 杨 军

(南华大学附属第一医院老年医学科，湖南 衡阳 421001)

硫化氢通过调控转化生长因子-β及基质金属蛋白酶-9/基质金属蛋白酶抑制剂-1改善糖尿病大鼠肾小管间质纤维化

李子宁 梁 彪 刘茂军 褚 春1曾 欧 李 琳 李 妍 杨 军

(南华大学附属第一医院老年医学科，湖南 衡阳 421001)

目的 探讨硫化氢(H2S)气体信号分子对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化及转化生长因子(TGF)-β、基质金属蛋白酶(MMP)-9/基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1表达的影响。方法 单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型将成年雄性SD大鼠64只随机分为正常对照组(Control组)、STZ组、STZ+H2S组、H2S组。造模72 h后采尾静脉血检测，若血糖>16.7 mmol/L表明造模成功。H2S组和STZ+H2S组大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol·kg-1·d-1，Control组和STZ组腹腔注射同等量生理盐水。8 w后取标本，Masson染色观察大鼠肾脏组织病理形态学改变，Western印迹检测大鼠肾脏TGF-β、MMP-9、TIMP-1、Ⅳ型胶原蛋白的表达水平。结果 与Control组相比，STZ组存在明显肾小管间质纤维化，同时肾脏组织中Ⅳ型胶原、TGF-β、TIMP-1蛋白的表达升高，MMP-9蛋白的表达水平下降(P<0.05)；与STZ组大鼠相比，STZ+H2S组肾小管间质纤维化减轻，肾组织TGF-β、TIMP-1、Ⅳ型胶原蛋白的表达降低，MMP-9蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论 H2S可改善糖尿病大鼠肾小管间质纤维化，其机制可能与调控MMP-9/TIMP-1失衡以及TGF-β蛋白的表达水平有关。

硫化氢；糖尿病；转化生长因子-β ；基质金属蛋白酶抑制剂-1；基质金属蛋白酶-9

糖尿病肾小管间质纤维化的发病机制尚不完全清楚，转化生长因子(TGF)-β可刺激间质细胞增殖及产生细胞外基质(ECM)，促进ECM沉积，诱导成纤维细胞合成ECM，是纤维化反应的重要介质〔1〕。肾小管间质纤维化与基质金属蛋白酶(MMP)-9/基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1的比例失调有关。Ⅳ型胶原是ECM的主要组成部分,MMP-9能特异性降解Ⅳ型胶原,对肾小管间质纤维化有重要影响〔2〕；TIMP-1通过拮抗MMP-9发挥作用。硫化氢(H2S)是具有传递细胞信号功能的内源性气体递质，在糖尿病进展过程中发挥较多生理效应。本文采用单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病动物模型，观察H2S对糖尿病大鼠模型肾小管间质纤维化的影响以及对Ⅳ型胶原、TGF-β、MMP-9和TIMP-1蛋白表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试验试剂、仪器 成年雄性SD大鼠64只，体重(300±25)g，购于南华大学动物试验中心；STZ购自美国MP Biomedicals Company，硫氢化钠购自美国Sigma公司；TGF-β、MMP-9、TIMP-1及Ⅳ型胶原一抗购自武汉博士德生物公司；鼠GAPDH单克隆抗体为广州晶欣生物科技有限公司产品；HRP抗兔二抗为北京博奥森生物公司产品，细胞裂解液、BCA试剂盒来自中国碧云天生物技术公司。电泳仪、电泳槽、转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及方法 将成年雄性SD大鼠先饲养1 w，恒温环境，白天黑夜各12 h，自由进食饮水，使其适应环境。按体质量随机分为正常对照(Control)组、STZ组、STZ+H2S组及H2S组各16只；大鼠禁食12 h后，通过单次腹腔注射STZ(40 mg/kg)建造糖尿病动物模型。为避免低血糖，24 h内予以大鼠5%葡糖糖代替饮水；非糖尿病大鼠注射等量柠檬酸钠；72 h后尾静脉取血，测血糖>16.7 mmol/L为糖尿病动物造模成功〔3〕。以硫氢化钠作为外源性H2S供体予以STZ+H2S组和H2S组大鼠连续8 w每日腹腔注射100 μmol/kg，Control组和STZ组大鼠腹腔注射等量生理盐水。8 w后以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，剖开腹腔取得肾脏标本后用冰生理盐水清洁冲洗，吸干水分，去除肾脏周围组织包膜、血管，取适量组织于100 g/L多聚甲醛中固定24 h，余肾脏标本保存待用。

1.2.2 Masson方法观察大鼠肾脏组织胶原纤维染色 取以甲醛固定的4组大鼠肾脏组织；经石蜡包埋,制成4～6 μm的切片；切片脱蜡后入5%铁明矾水溶液固定24 h；先后用自来水和蒸馏水冲洗，用Regaud苏木精染5～10 min；蒸馏水洗后入2.5%铁明矾水溶液，待细胞核显示清晰后流水洗10 min；入1%酸性复红染10 min；蒸馏水冲洗后加入1%磷钼酸水溶液分化3～5 min；加入含2.5%冰醋酸苯胺蓝饱和水溶液；蒸馏水洗；1%冰醋酸浸洗5 min；梯度酒精脱水后透明封固。阳性结果为胶原纤维呈蓝色，细胞核蓝褐色，胞质、肌纤维呈红色。

1.2.3 Western印迹检测Ⅳ型胶原、MMP-9、TIMP-1及TGF-β表达水平 取4组大鼠新鲜肾脏标本，以GAPDH为内参；裂解细胞后提取蛋白，进行BCA比色法蛋白定量；蛋白样品100℃煮沸5 min促使变性；以5%浓缩胶、10%分离胶SDS-PAGE凝胶电泳。恒压80 V电泳25 min，条带电泳至分离胶上缘后调整为恒压120 V、60 min；PVDF膜以甲醇浸泡5 min，置于转移缓冲液浸泡5 min，采用湿转法恒流200 mA、90 min，电转至PVDF膜。室温下以TBST配制的5%BSA摇床轻摇封闭1.5 h后，以Ⅳ型胶原、TGF-β、MMP-9、TIMP-1和GAPDH一抗(稀释浓度均为1∶500，37℃脱色摇床轻摇孵育1 h后4℃冰箱过夜，然后室温下以TBST(含20%Tween20)漂洗膜3次，10 min/次；用HRP标记的二抗(稀释度1∶4 000)37℃摇床孵育1 h，之后用TBST液漂洗3次；使ECL与膜作用1 min，化学发光显色，以Image J软件进行图像光密度分析，条带灰度比值分别表示TGF-β、TIMP-1、MMP-9和Ⅳ型胶原蛋白含量表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

实验过程中共死亡5只大鼠，其中STZ组2只，STZ+H2S组1只，H2S组2只，死亡原因推测为感染和糖尿病并发症。

2.1 尿蛋白测定 实验第8周Control组尿蛋白(11.8±3.3)mg，STZ为(44.5±6.4)mg，STZ+H2S组为(26.6±6.1)mg，H2S组为(12.6±4.0)mg。与Control组相比，STZ组显著增加(P<0.05)；与STZ组相比，STZ+H2S组明显出现尿蛋白定量下降(P<0.05)。

2.2 大鼠肾脏Masson染色 Control组肾小管间质仅可见少量蓝色胶原纤维沉积；STZ组大鼠肾脏组织染色结果表明较多蓝染的胶原纤维沉积，说明存在明显肾小管间质纤维化；而STZ+H2S组肾小管间质纤维化有所改善，大鼠肾脏组织蓝染胶原纤维沉积程度减轻；H2S组大鼠肾脏蓝染胶原纤维表达程度与Control组无明显差异。见图1。

图1 各组肾组织Masson染色结果(×200)

2.3 Ⅳ型胶原表达水平 STZ组(1.19±0.016)大鼠肾脏组织Ⅳ型胶原蛋白表达水平与Control组(0.89±0.068)相比明显上调(P<0.05)；与STZ组相比，H2S组(0.91±0.059)表达水平显著下调(P<0.05)。而H2S组与Control组比较无统计学差异(P<0.05)。STZ+H2S组为(0.76±0.076)。见图2。

2.4 TGF-β、TIMP-1和MMP-9蛋白在大鼠肾脏组织表达水平 STZ组与Control组相比，大鼠肾脏组织MMP-9蛋白表达水平显著下调〔STZ组(0.68±0.019),Control组(0.88±0.032)〕，TIMP-1〔STZ组(1.04±0.020)，Control组(0.83±0.015)〕及TGF-β〔STZ组(1.17±0.018)，Control组(1.01±0.005)〕蛋白表达水平明显上调(P<0.05)；STZ+H2S组TGF-β(0.85±0.015)和TIMP-1蛋白(0.84±0.053)表达水平较STZ组均有明显下调(P<0.05)，而MMP-9蛋白表达水平则表现为明显上调(0.94±0.059)。H2S组〔MMP-9(0.88±0.005),TGF-β：(0.99±0.036)，TIMP-1：(1.08±0.007)〕大鼠肾脏组织各蛋白表达水平与Control组无统计学差异(P>0.05)。见图2。

图2 Ⅳ型胶原、TGF-β、TIMP-1和MMP-9蛋白表达水平

3 讨 论

肾小管间质纤维化与肾脏终末期疾病具有明确的相关性，是导致糖尿病肾衰竭的重要病理改变；成纤维细胞是主要的介导肾小管间质纤维化的效应细胞，细胞内的信号转导通路如何导致间质纤维化很大程度上仍然未知。目前，TGF-β被认为是与组织纤维化关系密切的细胞因子，在组织纤维化的进展中发挥关键性的作用，TGF-β可诱导刺激成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、趋化炎性细胞浸润、增加ECM合成，此外还可抑制降解ECM的蛋白酶活性，通过抑制MMPs的表达和诱导TIMPs的合成，抑制ECM降解〔4〕。TGF-β还能直接诱导TIMP-1基因表达，从而介导细胞因子的致纤维化作用〔5〕。Campistol等〔6〕表明，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)正是通过减少TGF-β的合成和分泌途径预防肾间质纤维化。糖尿病患者ECM过多沉积和分解减少与肾小管间质纤维化也有密切相关，MMP-9及TIMP-1是调节基质降解的重要因子。肾小管间质纤维化程度与萎缩的肾小管细胞核内MMP-9的表达水平呈正相关，MMP-9可阻碍肾小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞，调节肾小管间质纤维化并保护肾小管基底膜和减少ECM的表达〔7〕。

本试验结果提示肾小管间质纤维化可能与TGF-β增多及其介导的MMP-9/TIMP-1失调有关；糖尿病时肾脏组织TGF-β表达水平上升和MMP-9/TIMP-1蛋白表达比例失调可能是导致肾小管ECM沉积乃至肾小管间质纤维化的重要原因。TGF-β表达上调可能是糖尿病进展过程中影响MMP-9/TIMP-1失调和ECM降解异常的一个重要机制〔8〕。

H2S是新发现的第三类气体信号分子〔9〕，研究表明H2S是高效的细胞色素C氧化酶抑制剂，其抑制作用具有可逆性；另有研究证实H2S对机体新陈代谢具有意义深远的影响〔10〕，对肾脏具有保护作用。新型信号分子的发现最终可能形成新的治疗策略，延缓肾脏疾病进展。有研究显示,H2S能改善肾小管间质纤维化，其机制与调节TGF-β蛋白的表达水平有关。本研究提示H2S具有减轻糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的治疗作用。H2S可抑制TIMP-1表达、增加MMP-9表达，显著改善两者之间的比例失调，这种作用很可能是通过抑制TGF-β的表达来完成的。H2S能改善肾小管间质纤维化，其作用可能与逆转MMP-9/TIMP-1蛋白表达比例失调有关，而且H2S还具有直接抑制TGF-β蛋白表达、改善肾小管间质纤维化的作用。这些结果表明，H2S可能是治疗肾小管间质纤维化的有前景的选择性治疗方法；而H2S逆转TGF-β介导的MMP-9/TIMP-1失调、改善肾小管间质纤维化的内部信号调控机制，以及未来的临床应用前景仍有待进一步研究。

1 Leask A,Abraham DJ.TGF-β signaling and the fibrotic response〔J〕.FASEB J,2004;18(7):816-27.

2 Boucher E,Mayer G,Londono I,etal.Expression and localization of MT1-MMP and furin in the glomerular wall of short and long-term diabetic rats〔J〕.Kidney Int,2006;69(9):1570-7.

3 Shiroi A,Yoshikawa M,Yokota H,etal.Identification of insulin-producing cells derived from embryonic stem cells by zinc-chelating dithizone〔J〕.Stem Cells,2002;20:284-92.

4 Yu HT.Progression of the chronic renal failure〔J〕.Arch Intern Med,2003;163(12):1417-29.

5 Schaefer L,Ham X,August C，etal.Differential regulation of glomerular gelatinase B(MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1) in obese Zucker rats〔J〕.Diabetologia,1997;40:1035-43.

6 Campistol JM,Iigo P,Jimenez W,etal.Losartan decreases plasma levels of TGF-β1 in transplant patients with chronic allograft nephropathy〔J〕.Kidney Int,1999;56(2):714-9.

7 Tsai JP,Liou JH,Kao WT,etal.Increased expression of intranuclear matrix metalloproteinase 9 in atrophic renal tubules is associated with renal fibrosis〔J〕.PLoS One,2012;7(10):e48164.

8 Singh R,Song RH,Alavi N,etal.High glucose decrease matrix metalloproteinase-2 activity in rat mesangial cells via transforming growth factor-beta 1〔J〕.Exp Nephrol,2001;9(4):249-57.

9 肖 婷，罗 健，吴志雄，等.硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化及CX40 和CX45 表达的影响〔J〕．中国老年学杂志，2015;35(11):6025-7.

10 Blackstone E,Roth MB.H2S induces a suspended animation-like state in mice〔J〕.Science,2005;308(5721):518.

〔2016-04-27修回〕

(编辑 滕欣航)

Hydrogen sulfide alleviates renal fibrosis in diabetic rats through TGF-β, MMP-9 and TIMP-1 signaling pathway

LI Zi-Ning, LIANG Biao, LIU Mao-Jun,etal.

Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，Hunan，China

Objective To explore the effects of hydrogen sulfide on glomerular fibrosis in diabetic rats and the expressions of TGF-β, MMP-9 and TIMP-1.Methods 64 adult male SD rats were randomly divided into control, streptozotocin(STZ), diabetic rats with H2S treatment (STZ+H2S) and normal rats with H2S treatment (H2S) groups.Diabetes mellitus was induced by the intraperitoneal injection of STZ. After the model was established successfully,the rats in STZ+H2S and H2S groups were given daily intraperitoneal injections of NaSH(100 μmol/kg)，while the rats in control and STZ groups were given saline.After 8 weeks,the pathologies of renal interstitial fibrosis were examined by Massion staining, and the expressions of CollagenⅣ, TGF-β, MMP-9 and MMP-1 were analyzed by Western blot.Results Compared with those of control group,the rats in STZ group showed obvious glomerular fibrosis in the nephridial tissue with significantly increased expression levels of CollagenⅣ, TGF-β and TIMP1 and decreased expression level of MMP9(P<0.05), while changes in STZ+H2S group were significantly reversed(P<0.05).Conclusions Hydrogen sulfide could alleviate glomerular fibrosis in diabetic rats,and the mechanism might involve the regulation of MMP-9/TIMP-1 imbalance and the level of TGF-β protein expression.

Hydrogen sulfide; Diabetes；TGF-β ；TIMP-1；MMP-9

国家自然科学基金(No.81270181)

杨 军(1972-)，男，博士，主任医师，硕士生导师，教授，主要从事心血管疾病研究。

李子宁(1978-)，男，硕士，主治医师，主要从事心肌重构与冠心病研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)03-0544-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.010

1 南华大学附属第二医院药剂科