大肠癌中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的表达及意义

张 丹 吕 亮 申兴斌 赵 杨 邵雪斋

(承德医学院附属医院CT科，河北 承德 067000)

大肠癌中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的表达及意义

张 丹 吕 亮1申兴斌2赵 杨2邵雪斋3

(承德医学院附属医院CT科，河北 承德 067000)

目的 研究Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3在大肠癌中的表达及临床病理。方法 采用MaxVision免疫组织化学法分别检测大肠腺癌、大肠腺瘤及正常大肠黏膜组织中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的表达，分析表达结果与患者的年龄、性别、肿瘤组织浸润程度、分化程度、Dukes分期及淋巴结转移之间的关系。结果 大肠腺癌组织中Survivin和NF-κB阳性表达(100%，100%)高于大肠腺瘤(80%，90%)及大肠正常黏膜组织(25%，35%，P<0.01，P<0.05)。大肠腺癌中I-κB和Caspase-3的阳性表达(22%，24%)明显低于大肠腺瘤组织(80%，70%)及大肠正常黏膜组织(80%，85%，P<0.01)。大肠腺癌中NF-κB和I-κB的阳性表达与Dukes分期及淋巴结转移密切相关(P<0.05)。在大肠腺癌中Survivin的阳性表达与Caspase-3呈显著负相关(r=-0.697，P<0.01)，与NF-κB呈显著正相关(r=0.639，P<0.01)，与I-κB呈显著负相关(r=-0.613，P<0.01)；Caspase-3的阳性表达与NF-κB呈显著负相关(r=-0.601，P<0.01)，与I-κB呈显著正相关(r=0.616，P<0.01)；NF-κB的表达与I-κB呈显著负相关(r=-0.822，P<0.01)。结论 Survivin、NF-κB高表达及I-κB与Caspase-3低表达是大肠腺癌发生的必然事件，联合检测上述指标有助于大肠腺癌的诊断。NF-κB及I-κB在大肠腺癌的浸润生长及远处转移过程中发挥着一定的作用。联合检测该四个因子不能用于全面评价大肠腺癌的预后。

大肠腺癌；Survivin；NF-κB；I-κB；Caspase-3

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率呈明显上升趋势。大肠癌的发生发展是多基因参与，多途径，多阶段的过程，其中细胞增殖与凋亡失衡起着重要的作用〔1〕。Survivin和NF-κB是凋亡抑制因子，I-κB为NF-κB的免疫抑制剂，Caspase-3是内源性和外源性凋亡通路中与细胞凋亡关系最密切和必需的。这几个因子均是细胞凋亡调控中的重要因子。目前，国内对Survivin、Caspase-3在大肠癌的表达研究较多，二者联合NF-κB的研究较少，而再同时联合检测I-κB指标的研究尚无。本研究采用MaxVision免疫组化法在大肠正常黏膜、腺瘤及癌组织中共同检测Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的表达，分析此四项指标在大肠癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年11月1日至2012年9月30日在承德医学院附属医院手术切除的大肠癌(大肠癌癌肿及距癌肿边缘5 cm的癌旁组织)蜡块标本50例，所有患者术前未进行放化疗治疗，男25例，女25例；年龄23～83(中位59.5)岁。收集大肠腺瘤标本10例，男7例，女3例；年龄43～73(中位57.6)岁。随机收集上述50例大肠腺癌标本中的20例蜡块标本的边缘(距癌肿边缘>5 cm以上，经病理证实为正常黏膜)作为大肠正常黏膜组。

1.2 主要试剂 兔抗人Survivin单克隆抗体、鼠抗人NF-κB单克隆抗体、鼠抗人I-κB多克隆抗体及兔抗人Caspase-3多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，即用型快捷免疫组化MaxVision试剂盒羊抗鼠/兔及即用型DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 实验方法 石蜡切片(5 μm)，电热恒温箱80℃，烘烤50 min，二甲苯脱蜡至水。3%过氧化氢室温孵育10 min。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，在微波炉里加热0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)至沸腾后将上述组织切片放入，抗原热修复15 min，室温放置40 min，PBS冲洗3次，每次5 min。山羊血清封闭。滴加Ⅰ抗50 μl (Survivin工作液；Caspase工作液；NF-κB 1∶200工作液；I-κB 1∶200工作液)，4℃冰箱过夜。PBS洗3次，每次5 min。滴加Ⅱ抗(快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物)，室温孵育15 min。PBS洗3次，每次5 min。DAB显色5 min，终止显色，蒸馏水冲洗。苏木精复染，透明、封片、镜检。

1.4 结果判定 采用阳性染色强度结合阳性细胞所占百分比进行判断。采用Volm双评分法进行判定〔2〕，在染色均匀的区域，在400倍视野下，每张切片随机观察4个视野，将切片中平均阳性比例及染色深浅分别计0～4分，切片中无阳性细胞0分，阳性细胞<25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，>75%计4分；染色强度以多数细胞为准；无着色计0分，浅棕黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分，再按这两项指标的积分相加将结果分为4级：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中度阳性()，5～6分为强阳性()。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行秩和检验、Pearson直线回归及Spearman等级相关分析。

2 结 果

2.1 Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3在各组织中的阳性表达 见图1。Survivin、I-κB及Caspase-3主要定位于细胞质，以细胞质内出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性反应；NF-κB主要定位于细胞核，以细胞核内出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性反应。在大肠正常黏膜组织、大肠腺瘤组织及大肠腺癌组织中，Survivin的阳性表达分别为25%、80%、100%，呈逐渐递增趋势； NF-κB的阳表达分别为35%、90%、100%，亦呈逐渐递增趋势；I-κB的阳性表达分别为80%、80%、22%，呈逐渐递减趋势；Caspase-3的阳性表达分别为85%、70%、24%，亦呈逐渐递减趋势。Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3在大肠腺癌组织中的阳性表达与大肠正常黏膜组与大肠腺瘤组比较有统计学差异(均P<0.01)；Survivin及NF-κB在大肠腺瘤组织中的阳性表达与大肠正常黏膜组比较亦有统计学差异(P<0.01)；而I-κB及Caspase-3在大肠腺瘤组织中的表达与大肠正常黏膜组比较无统计学差异(P>0.05)。

正常组织Survivin阴性

正常组织NF-κB阴性

正常组织I-κB阳性

正常组织Caspase-3阳性

腺癌组织Survivin阳性

腺癌组织NF-κB阳性

腺癌组织I-κB阳性

腺癌组织Caspase-3阴性

腺瘤组织Survivin阳性

腺瘤组织NF-κB阳性

腺瘤组织I-κB阴性

腺瘤组织Caspase-3阴性图1 Survivin、NF-κB、I-κB、Caspase-3在大肠正常组织、腺癌组织及腺瘤组织中的表达(DAB,×200)

2.2 大肠腺癌中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的阳性表达与临床病理指标间的关系 大肠腺癌组织中NF-κB与I-κB的阳性表达在Dukes分期A+B期与C+D期分组以及有无淋巴结转移分组中的比较有统计学差异(P<0.01)。Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的阳性表达在患者性别、年龄、组织分化程度、肿瘤浸润深度分组中的比较无统计学差异(P>0.05)。Survivin及Caspase-3的阳性表达在Dukes分期以及有无淋巴结转移分组中亦无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.3 大肠腺癌组织Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3阳性表达相关性 大肠腺癌组织中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3阳性表达间均具有相关性(P<0.01)，见表2。

表1 大肠腺癌中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的阳性表达与临床病理特征的关系(n)

表2 大肠腺癌组织中Survivin、NF-κB、I-κB及 Caspase-3阳性表达的相关性

3 讨 论

正常肠道黏膜存在着细胞凋亡，清除衰老的细胞，维持黏膜细胞的生理平衡。细胞凋亡受抑制，有利于肿瘤的发生和发展。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的新成员，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin具有抑制凋亡和调节细胞增殖的双重作用〔3〕。NF-κB是一种核蛋白基因，它能参与机体的免疫应答，多种基因的调控以及细胞凋亡。目前多数研究表明Survivin及NF-κB与多种肿瘤有着密切的关系〔4～6〕。本研究结果提示Survivin及NF-κB的表达上调是大肠癌发生的必然事件，这也提示可将Survivin及NF-κB作为大肠癌的早期诊断的肿瘤标志物。研究显示，Survivin及NF-κB在大肠癌中的高表达与大肠癌的临床病理指标间或多或少的具有相关性〔7～10〕。而本研究显示，NF-κB的表达虽然对大肠癌的发展程度有一定的提示意义，但是不能依靠Survivin及NF-κB的表达全面评估大肠癌的生物学行为，也可能因为本研究样本量小，尚需大样本进一步研究。

I-κB作为NF-κB的胞质抑制蛋白，本研究结果提示在大肠癌中，单独检测I-κB可以替代NF-κB，同样具有诊断价值。但是Thompson等〔11〕认为不同的外界刺激通过一个或多个信号传导途径，作用于不同的I-κB可以引起NF-κB有差别的活化。而且，李道明等〔12〕研究显示，食管鳞癌中NF-κBp65的表达低于I-κBα的表达，两者之间无相关性，提示NF-κBp65蛋白与I-κBα蛋白的表达是各自独立的事件。因此，在不同肿瘤组织中，I-κB与NF-κB可能不能相互替代检测，这可能是NF-κB和I-κB两个基因的家族成员之间关系的复杂性所致。

Caspase-3是Caspase蛋白酶家族成员之一，是已知内源性和外源性凋亡通路中与细胞凋亡关系最密切和必需的，被称为凋亡的执行者。多数学者〔13～15〕研究显示Caspase-3在肿瘤组织中低表达，本研究亦显示了这一特点，即Caspase-3在大肠正常黏膜、大肠腺瘤和大肠癌中的阳性表达呈递减趋势。本研究还显示Caspase-3在大肠癌组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的分化程度、浸润深度、Dukes分期及淋巴结转移均无相关性，与多数学者〔15，16〕研究结论不符，推测原因是Caspase-3可能不直接参与及影响大肠癌的演变过程，只是大肠癌发生的一个结果，是其他因子引起大肠癌的一个必然过程，故无法应用Caspase-3的表达情况对大肠癌的进展情况及预后进行评估。本研究结果显示大肠癌中Survivin、NF-κB均为高表达，而Caspase-3为低表达，Survivin、NF-κB分别与Caspase-3在大肠癌中的表达呈负相关，且三者之间均有相关性，那么可以推断Survivin、NF-κB可能协同作用于Caspase-3而发挥抑凋亡、促增殖的作用。本研究还显示，Survivin与I-κB呈负相关、Caspase-3与I-κB呈正相关，但尚无文献报道两者之间的关系，推断机制可能为Survivin协同NF-κB抑制Caspase-3，而I-κB通过抑制NF-κB活性间接抑制了Survivin活性，但尚需进一步研究。

1 柴 漫.大肠癌中NF-κB及Livin蛋白表达与细胞凋亡指数的关系〔J〕.山东医药，2011；51(1)：48-9.

2 Volm M，Koomagi R.Mattern prognathic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer〔J〕.Int Cancer，1997；74(1)：64-8.

3 Tamm I，Wang Y，Sausville E，etal.IAP-family protein Survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95)，Bax，caspases，and anticancer drugs〔J〕.Cancer Res，1998；58(23)：5315-20.

4 常玉珍，李秀梅，封 敏，等.Survivin、NF-κB和STAT3 mRNA在宫颈癌中的表达及其临床意义〔J〕.癌变·畸变·突变，2014；26(3)：189-92.

5 庞雅青.Survivin、NF-κB、VGEF-C与食管癌血管形成的关系〔J〕.河南医学研究，2010；19(2)：249-52.

6 Wu YF，Liang XJ，Liu YY，etal.Antisenseoligo nucleotide targeting Survivin inhibits growth by inducing apoptosis in human osteo sarcoma cells MG-63〔J〕.Neoplasma，2010；57(6)：501-6.

7 郑国文.大肠癌中LIVIN和Survivin的表达及相关性研究〔J〕.实用医院临床杂志，2014；11(2)：86-7.

8 杨志诚，赵云刚，刘明雨.Survivin、NF-κB在结直肠癌中的表达及临床意义〔J〕.河北医药，2013；35(12)：1834-5.

9 Jin Li，Xiaonian Cao，Yu Deng，etal.Immunohistochemical study of nuclear factor-κB activity in colorectal cancer〔J〕.Chin-German J Clin Oncol，2011；10(7)：406-9.

10 李 佽，陈志英.NF-κB及COX-2在大肠癌中表达相关性〔J〕.四川医学，2013；34(8)：1102-4.

11 Thompson JE，Phillips RJ，Erdjument H.I kappa B-beta regulates the persistent response in a biphasic activation of NF-kappa B〔J〕.Cell，1995；80(4)：573-82.

12 李道明，李珊珊，赵志华，等.核转录因子κBp65蛋白及其抑制蛋白IκBα表达与食管鳞癌浸润转移的关系〔J〕.中国肿瘤临床，2005；32(9)：497-512.

13 王文娟，高玉彤.PUMA、COX-2、Caspase-3在结直肠癌中的表达及临床意义〔J〕.山东医药，2011；51(11)：15-7.

14 常方芝，田字彬.FHIT、Caspase-3及Survivin在结直癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.大连医科大学学报，2011；33(4)：330-4.

15 樊勇军，冯一中，李 海，等.Survivin、Caspase-3及AKT1在大肠癌中的表达及意义〔J〕.实用癌症杂志，2010；25(1)：26-30.

16 袁德汉，康举龄，苏艳桃，等.Caspase-3在正常结肠黏膜、结肠腺瘤及结肠癌中的表达及其临床意义〔J〕.中国医师进修杂志，2012；35(32)：4-6.

〔2015-09-23修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

申兴斌(1969-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事病理诊断研究。

张 丹(1974-)，女，副主任医师，硕士，主要从事影像诊断研究。

R735.3

A

1005-9202(2017)03-0549-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.012

1 承德护理职业学院医学技术系

2 承德医学院附属医院病理科

3 承德医学院附属医院妇科