胃肠道平滑肌细胞培养及鉴定

高静 徐晓霞 陈平（内蒙古医科大学附属医院消化内科，内蒙古呼和浩特010010）

·综述·

胃肠道平滑肌细胞培养及鉴定

高静 徐晓霞 陈平
（内蒙古医科大学附属医院消化内科，内蒙古呼和浩特010010）

胃肠道平滑肌原代细胞培养基本保留了体内生长特性，作为一种体外研究模型，在生理学、病理学、胃肠动力学和药物代谢动力学等较多研究领域显示出细胞株所不具备的优越性。本文就胃肠道平滑肌原代细胞的分离、培养、纯化和鉴定方法方面进行了综述，为研究消化系统疾病培养胃肠道平滑肌细胞方法的选择提供参考。

胃肠道平滑肌细胞；分离；培养；纯化；鉴定

胃肠道平滑肌组织在人和动物体内分布广泛，是构成人体消化道的重要空腔脏器，通过收缩蠕动来协助器官的功能发挥。胃肠道平滑肌原代细胞由于刚刚从活体组织分离出来，生物学特性还未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，可反映出体内生长的一般性质，适合用于胃肠动力学、运动调节机制及药物研究等[1]。但由于获得胃肠道原代细胞的过程较复杂、培养困难，使得原代细胞还不能成为实验材料的首选对象。原代细胞是否培养成功主要与细胞的分离、培养方法有关，因此有效分离原代细胞并保持其相应的生物学特性，找到适合其生长的环境尤为重要。

1 取材

胃肠道平滑肌细胞培养主要来自于SD乳鼠、小鼠、大鼠、豚鼠及家兔等，取材前务必将实验动物禁食12 h以上（未进食的可直接用于实验），分离材料时应在手术显微镜或解剖显微镜下进行，以达到分离完全的目的，分离后应用4℃含双抗（青霉素，链霉素）的PBS液反复冲洗，直至组织块发白，再用不含血清的培养基冲洗1～2遍，将洗好的组织剪成1～2mm3大小组织块，在剪碎的过程中要保持湿润，最好使用不含血清的培养基，使用的刀剪尽量锋利，预防对组织的撕拉等造成损伤，应尽量缩短取材的时间。避免污染是GSMC培养的基础，操作过程中应严格无菌操作。

2 胃肠道平滑肌原代细胞的分离方法

2.1 组织块培养法：组织块培养法就是将组织剪成小块后，直接接种到一定的培养基质上，培养4～14 d后，细胞就会从这些组织块四周游出，10～14 d细胞融合。组织块培养法是分离胃肠道平滑肌细胞（Gastrointestinal smooth muscle cells，GSMC）最简单的方法，具有经济、操作简单、可反复利用组织块等优点[2]，能够获得高纯度的单细胞，且分离的GSMC由于未经过酶处理其活性较好、增殖能力也较强。缺点是培养周期长且难传代[3]，易被成纤维细胞污染。适用于较少组织的细胞培养和易被消化酶影响电活动的细胞培养，如oddi括约肌和Cajal间质细胞培养。吴志轩等[4]用组织块法成功培养出Cajal间质细胞，并证实了该方法短期培养的细胞保持了节律性内向电流的特性，可以用来研究起搏电活动。Thuneberg认为[5]，酶的浓度过高或者消化时间过长，均会对Cajal间质细胞产生损害，应该降低酶的浓度或在低温下消化，但消化不充分达不到分散细胞的目的，因此组织块培养法是目前研究Cajal间质细胞发育过程和功能特性的比较理想的模型[6]。

2.2 酶消化法：酶消化法是将组织用酶进行消化，使细胞分散，并去除妨碍细胞生长的细胞间质等。酶消化法培养周期短，短期内细胞收获量大（可在消化1～6 h后即可获得较纯的GSMC，5 d左右细胞融合），但酶浓度和作用时间不易掌握，且消化酶本身对细胞有毒性作用，可致培养失败。由于酶消化法能在短期内获得大量原代细胞，大大的节约了时间，故学者们多采用酶消化法分离原代细胞。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对GSNC的影响不大可使细胞有效分离，是分离SMC最常用的酶，常用的主要有Ⅰ、Ⅱ型胶原酶。蒋锋利等[7]用Ⅱ型胶原酶成功培养出SD乳鼠胃肠平滑肌细胞，并证明培养的细胞95%以上为GSMC。祝捷等[8]用Ⅱ型胶原酶成功培养出豚鼠近段结肠平滑肌细胞，并做穿孔全细胞模式膜片钳实验。为了达到更好的消化效果，近年来很多学者尝试采用联合酶消化法。刘东海[9]等用Ⅰ型胶原酶联合木瓜蛋白酶成功分离出小鼠胃窦平滑肌细胞。丁术旺等[10]用Ⅱ型胶原酶联合胰酶成功解离出家兔oddi括约肌细胞，并将其传代培养。还可在酶消化的过程中加入大豆胰蛋白酶抑制剂（避免实验中破碎的细胞释放大量的胰蛋白酶被激活对实验造成影响）、牛血清白蛋白、二硫苏糖醇等。

3 胃肠道平滑肌原代细胞的培养

平滑肌细胞的基本功能相同，但不同器官来源的平滑肌细胞在形态、特定功能和基因表达方面都存在根本差异，而且细胞生长所需要的环境也有区别，因此对培养条件的要求也会存在一定的差别。在进行体外培养时，要根据平滑肌的来源选择合适的培养条件以尽可能地模拟体内环境，使细胞在体外培养条件下能较好生长和繁殖。

3.1 培养液的组成：GSMC原代培养时用10%～20%的胎牛血清，GSMC培养最常用的培养液为DMEM、M199、1640等，蒋锋利等[7]认为对于GSMC的分离培养，M199作为基本培养基优于DMEM。其中还可添加抗生素，常用的有青霉素/链霉素等，如果配制的培养基超过2周时，可加入L-谷氨酰胺。

3.2 细胞的传代：当原代细胞生长达培养瓶80%～90%时或80%细胞融合时，可进行细胞的传代培养，0.25%胰酶（含EDTA）是传代时常用的消化酶，加入适当胰酶镜下观察至胞质回缩，间隙增大时及时终止消化。传代时用1∶2的形式传代，传至5代以后细胞开始出现老化且活性降低甚至失去分裂能力。因此应选取3～5代作为试验用细胞来源。

4 胃肠道平滑肌原代细胞的纯化

原代GSMC分离时由于黏膜组织及表面结缔组织剥离不尽，容易混入成纤维细胞，在传代过程中成纤维细胞的生长速度快，会很快取代GSMC，因此需要纯化GSMC。由于成纤维细胞和GSMC的贴壁时间不同及对胰酶的敏感性不同（成纤维细胞能较快贴壁，而GSMC贴壁时间在1～4h以上，成纤维细胞先于GSMC脱壁，特别是在原代和培养早期的细胞这种差别尤为明显），因此可以利用反复贴壁法和胰酶/EDTA差时消化法来纯化GSMC。当GSMC的组织量多于成纤维细胞的组织量时，可利用自然纯化法纯化GSMC（因GSMC的增殖优势抑制成纤维细胞的生长），GSMC的纯度会随着传代次数的增加而逐渐增高。为了更好地纯化细胞，可根据实际情况联合应用几种纯化方法进行纯化。

5 胃肠道平滑肌原代细胞的鉴定

培养的GSMC生长均一，大部分呈梭形状，胞核位于中央，根据丁术旺等[10]报道的培养方法，培养成功后的oddi括约肌纯度通过检测证实阳性，aactin染色阳性。成纤维细胞由于和GSMC形态具有相似性[11]，故尚需进行GSMC的鉴定。鉴定GSMC的方法有倒置显微镜观察、免疫组化法、免疫荧光染色法等。

6 胃肠道平滑肌细胞的运动机制

GSMC的运动是通过GSMC的收缩与舒张实现的。在此过程中，伴随离子通道开放、关闭。离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦即产生生物电现象的基础。目前认识GSMC收缩和舒张的机制：首先外界的刺激致使细胞膜去极化，电压依赖性钙离子通道开放，钙离子内流，同时肌浆网内储存钙也释放入胞浆。二者共同使[Ca2+]i显著升高，宏观表现为GSMC收缩。然后增高的胞浆钙主要通过位于细胞膜和肌浆网上钙泵及细胞膜的钠钙离子交换泵等途径逆浓度差的转运到细胞外或肌浆网内，从而使[Ca2+]i降低，进而恢复到静息水平，细胞舒张，宏观变现为GSMC舒张。

7 小结与展望

GSMC培养技术同其它细胞培养技术一样正在日臻完善。随着基因工程及分子生物学技术的发展，GSMC培养的研究必将进入分子水平，而膜片钳技术的快速发展为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透性、选择性等膜信息，提供了最直接的手段，使人们对细胞膜通道功能的认识进入了一个崭新的阶段。膜片钳技术与其它技术结合必将为消化系统疾病的病因、机理研究发挥更大作用。

［1］Sygitowicz G，Zapolska-Downar D，Paluch M，et al.Bovine corneal epithelial primary cultures as an in vitro model for ophthalmicdrugsstudies［J］.JActaPolPharm，2011，68（5）：745-751.

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Culture and Identification of Gastrointestinal Smooth Muscle Cells

Gao JingXu XiaoxiaChen Ping
（Department of Gastroenterology，The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010010，China）

Primary gastrointestinal smooth muscle cells cultured basis retention in vivo growth characteristics，as a model for the in vitro studies，in the Physiology，pathology，gastrointestinal motility and pharmacokinetics of drug large areas show cell lines do not have the advantages of.In this paper，the methods of isolation，culture，purification and identification of gastrointestinal smooth muscle cells were reviewed，which provides references for the study of options of gastrointestinal smooth muscle cells in digestive system diseases.

Gastrointestinal smooth muscle cells；Isolation；Culture；Purification；Identification

R573

A学科分类代码：32024

1001-8131（2017）02-0185-03

2016-10-14

国家自然科学基金＜钙离子通道在oddi括约肌运动功能中的调节机制以及在急性胰腺炎发生过程中的作用＞（81260072）