督脉电针对慢性脑缺血大鼠OX2R及其配体表达的影响

刘瑜，陈洪琳，罗正凯，王淑荣，刘丹*

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

督脉电针对慢性脑缺血大鼠OX2R及其配体表达的影响

刘瑜1，陈洪琳2，罗正凯2，王淑荣2，刘丹2*

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究督脉电针在慢性脑缺血时大鼠脑食欲素受体-2(OX2R)及其配体在不同时间点缺血后的变化。方法：实验中运用分次结扎双侧颈总动脉法建立慢性脑缺血模型，将Wistar大鼠分4组，造模成功后给予督脉电针干预，免疫组织化学法观察OX2R 的表达，同时运用ELISA技术检测各组大鼠额叶皮质区Orexin-A和Orexin-B的总含量变化。 结果：1个月、2个月时,模型组OX2R及其配体表达高于正常组，同时呈递增趋势；在相同时间进行组间比较，1个月时，模型组和针刺治疗组OX2R及其配体的表达无显著差别，立即针刺组OX2R及其配体的表达较模型组有升高；2个月时针刺治疗组OX2R及其配体表达较模型组有明显升高，而立即针刺组与针刺治疗组相比OX2R及其配体表达有升高。 结论：实验观察到OX2R及其配体的表达在1个月和2个月时随着时间延长而升高,经过督脉电针干预后促进了OX2R及其配体表达，同时观察到早期干预对OX2R及其配体表达的影响优于针刺治疗组。

督脉电针；慢性脑缺血；Orexin；OX2R

慢性脑供血不足(chronic cerebral circulatoryinsufficiency)是指大脑的血液供应量降低的一种状态[1]。临床工作中发现长期慢性脑供血不足可使脑组织产生慢性脑缺血,进而出现不同程度上的病理损伤,如果治疗不及时,可以导致认知功能下降,重者会出现缺血性脑卒中以及痴呆、Alzheimer等疾病[2],有研究[3]表明慢性脑缺血会导致OX2R及其配体发生变化。近年来，慢性脑缺血导致的脑梗死及脑血栓等疾病也逐年增多，是导致中老年人致死、致残的主要原因[4-5]。本研究通过结扎双侧颈总动脉法建立慢性脑缺血的大鼠模型，观察大鼠脑内OX2R及其配体的表达情况，同时运用督脉电针在不同时期进行干预，观察干预后的疗效，并初步探讨其作用机制。

1 材料及方法

1.1 试剂与动物

选取黑龙江中医药大学动物实验中心提供的Wistar大鼠70只,大鼠山羊抗多克隆OX2R抗体购于Santa Cruz公司，于北京中杉生物技术有限公司购买免疫组化SP试剂盒，CY3标记山羊及FITC标记小鼠Ⅱ抗荧光试剂购于武汉博士德生物试剂公司，CWB10购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 慢性脑缺血大鼠模型建立及实验分组

参照刘丹[6]分次永久性结扎大鼠双侧颈总动脉制作脑缺血大鼠模型 ,实验大鼠随机分为正常组和模型组、立即针刺组和针刺治疗组，正常组无任何处理，模型组、立即针刺组及针刺治疗组分别分为1个月和2个月2个亚组，每组大鼠10只，立即针刺组造模开始就进行督脉电针干预，针刺治疗组造模术后3周进行督脉电针的干预。

1.3 操作方法

运用督脉电针对针刺后的督脉穴(神庭和百会、风府和大椎)进行干预，给予持续脉冲电流及疏波，频率和强度分别为2 Hz、2 mA，出现头部轻微抖动最佳，并于每日同一时间进行时长为20 min的针刺，每日1次。

1.4 脑组织切片的制备与脑组织OX2R的表达水平测定

于同一固定时间分别对2VO术后各组进行相应的标本采集，两个治疗组的大鼠于治疗结束后同一时间段进行标本采集。DAB显色，在镜下控制时间，运用光镜观察。OX2R主要表达在海马CA3区，随机选择5个镜下视野的1 000个细胞，并于光镜下计算其阳性细胞数。

1.5 ELISA法检测

实验过程中的1个月、2个月时，每组在每个时间点，均处理10只大鼠，取下大鼠脑内组织，应用组织蛋白抽提试剂盒，提取其相应的组织蛋白，经冷冻离心处理后，取其上清液，用BCA法测定其蛋白的浓度，用ELISA法检测其中Orexin-A和Orexin-B的总含量。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 OX2R 的表达

表1 OX2R阳性细胞数个/5个视野1 000个细胞)

注：与正常组比较，▲P<0.05；与同一时间点模型组比较，■P<0.05；与立即针刺治疗组比较,★P<0.05

实验结果表明： 造模开始后1个月模型组OX2R的表达较正常组升高，并在2个月时进一步增高；同一时间点的组中OX2R表达，1个月时模型组与针刺治疗组比较无明显差异(P>0.05)，而立即针刺组高于模型组(P<0.05)；2个月时治疗组明显高于模型组(P<0.05)，立即针刺组与针刺治疗组相比有升高(P<0.05)。

2.2 ELISA检测

表2 皮质区Orexin-A和Orexin-B的总含量

注：与正常组比较，▲P<0.05；与同一时间点模型组比较，■P<0.05；与针刺治疗组比较,★P<0.05

实验结果:造模成功后1个月时测定Orexin-A及Orexin-B的总含量，模型组与正常组相比较有升高(P<0.05),2个月时，模型组与正常组相比较明显升高(P<0.05),即OX2R的表达有升高；同时1个月时，模型组与针刺治疗组相比较无显著性差异(P>0.05)，立即针刺组与模型组比较有升高(P<0.05),即OX2R的表达上升；2个月时，3组Orexin-A及Orexin-B的总含量呈“模型组、针刺治疗组、立即针刺组”递增趋势，差异有显著性意义(P<0.05),即OX2R的表达呈递增趋势。

3 讨论

食欲素(orexin)系统是与摄食、睡眠-觉醒周期、消化、激素分泌活动调节有关的大脑内神经递质系统[7]。Orexin系统中包含Orexin-A与Orexin-B，能与2个与其配对的G蛋白受体食欲素受体1和食欲素受体2相结合后调控机体的营养和能量平衡、睡眠-觉醒周期，其中食欲素受体1对其配体有严格选择性，但食欲素受体2对其配体(Orexin-A或Orexin-B)并没有严格的选择性[8-11]。在人类与小鼠中Orexin-A与Orexin-B均可通过Orexin系统的G蛋白耦联受体OX2R而发挥作用。督脉电针对慢性脑缺血的治疗在临床应用中疗效较明显，而督脉又有上达脑窍入髓海的作用，电针的应用可以进一步加强针刺督脉后对慢性脑供血不足的影响。实验通过直接观察慢性脑缺血大鼠在缺血后期脑内OX2R及其配体的表达情况和测定Orexin-A与Orexin-B的含量变化情况反应经督脉电针干预后对OX2R产生的影响。实验结果显示的数据变化与吕瑞娟等[12]的研究结果是相一致的。同时Katsuki[13]等研究也表明在缺血2个月时大鼠学习及记忆能力的好转可能与OX2R介导的神经细胞保护作用有关。同时有研究表明，神经元受损是缺血性脑损伤发病的重要机制之一[14]。因此Orexin受体-2在大鼠慢性脑缺血的病理过程中起到了调节作用，而督脉电针可以对OX2R的表达产生影响,说明经过督脉电针的干预后能够对大鼠脑内OX2R的表达情况起到良性的调节作用，可能提示督脉电针对慢性脑缺血大鼠缺血后期导致的大脑的神经细胞的损伤有一定防治作用。

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Effect of Electronic Acupuncture of DU on OX2R and Its ligand Expression of Chronic Cerebral Ischemia Rats

LIU Yu1，CHEN Hong-lin2，LUO Zheng-kai2，WANG Shu-rong2，LIU Dan2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040,China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective：To explore the effect of electronic acupuncture of DU on OX2R and its ligand expression of rats with chronic cerebral ischemia in different time points. Methods：Establish the cerebral ischemic models by fractionally ligating bilateral carotid arteries. The Wistar rats were divided into four groups.After the success of building,the electronic acupuncture of DU was used for intervention and measure the OX2R expression by immunohistochemical technique. Orexin-A and Orexin-B in frontal cortex were examined via ELISA techniques.Results：After one month, the expression levels of OX2R and its ligand were higher and the level of OX2R and its ligand were significantly higher in the model group than those in control group.Compared between groups at the same time, there was no significant difference in statistics of one month between the model group and the acupuncture group, but the expression level of OX2R and its ligand in the immediate acupuncture group were higher than those in the model group. The OX2R and its ligand expression after two months in acupuncture group were increased obviously compared with those in the model group, and the OX2R and its ligand expression of immediate acupuncture group were increased compared with thos in the acupuncture group. Conclusion：The expression levels of OX2R and its ligand have an increased trend with the extension of time during one month and two months. The electronic acupuncture of DU can promote the expression levels of OX2R and its ligand,and the early intervention is superior to the acupuncture treatment group.

DU electronic acupuncture；Chronic cerebral ischemia；Orexin；OX2R

2016-10-24

2016-11-29

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541760)

刘瑜(1991-)，女，硕士研究生，研究方向:针刺防治神经系统疾病的临床与基础研究。

*通讯作者：刘丹(1972-),女,博士,副教授,主任医师,硕士研究生导师，研究方向:针刺防治神经系统疾病的临床与基础研究。

R245.9+R743

A

1002-2392(2017)01-0057-03