丹参饮精品中药与普通中药四种酚性成分的比较研究

谢名君，焦亚斌，李环，林雨珊

(深圳大学医学部，广东 深圳 518060)

中 药 研 究

丹参饮精品中药与普通中药四种酚性成分的比较研究

谢名君，焦亚斌*，李环，林雨珊

(深圳大学医学部，广东 深圳 518060)

目的：建立高效液相色谱法测定丹参饮中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B的含量，比较丹参饮精品中药与普通中药上述四种成分的含量变化。方法：采用Genmini 5 μm C18110A(250 mm×4.60 mm,5 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)溶液为流动相，梯度洗脱,流速0.8 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长288 nm，进样量15 μL。结果：在40 min内，丹参饮中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、丹酚酸B四种酚性成分能够实现完全分离，并且浓度与峰面积在一定范围内线性关系良好，相关系数r≤0.999 8。与普通中药相比，丹参饮精品中药中丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛和原儿茶酸含量明显增加。 结论：该分析方法专属性好，灵敏度高，定量准确，经方法学验证可用于测定丹参饮中四种酚性成分的含量。

高效液相色谱法；丹参饮；酚性成分

随着生活水平的提高，心血管疾病的发病率逐年增加，心血管疾病已经成为危害人类健康的一大杀手，给国家和人民带来沉重的负担。丹参饮出自《时方歌括》，由丹参，檀香和砂仁组成，主治心痛、胃脘诸痛。方中丹参为君药，活血调经，祛瘀止痛，养血安神。檀香善行胸膈脾胃之气，而砂仁行气调中，和胃醒脾。三者合用，增强活血化瘀、行气止痛的功效。近年来，丹参饮广泛应用于心血管疾病[1]如冠心病，心力衰竭，慢性肺源性心脏病等的治疗，取得了确切的疗效。本课题组[2]研究丹参饮精品中药和普通中药对动脉粥样硬化(AS)大鼠药理作用，丹参饮能明显降低AS模型大鼠血脂，且丹参饮精品中药好于丹参饮普通中药。鉴于精品中药和普通中药丹参饮药理作用上的差异，本课题利用高效液相色谱法，研究丹参饮药理作用的物质基础，并比较丹参饮精品中药和丹参饮普通中药的物质基础的区别。

1 仪器与试药

Agilent LC 1260高效液相色谱仪(在洗脱气机 G1322A ；二元泵 G1312B； 自动控温自动进样器 G1329B ；二极管阵列检测器 G4212B)。CO-1000柱温箱(武汉恒信仪器)；XS205分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；宝来陶瓷煎药壶(广兴系列);SB 25-12DTDW超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

精品中药丹参药材(C2P063601，产地四川，深圳市和顺堂本草药业有限公司)；精品中药檀香药材(C2D037901，产地广东，深圳市和顺堂本草药业有限公司)；精品中药砂仁药材(C2P063601，产地广东，深圳市和顺堂本草药业有限公司)；普通中药丹参药材(130301，产地河北，深圳市康程医药有限公司)；普通中药檀香药材(130301，产地印度，深圳市康程医药有限公司)；普通中药砂仁药材(130301，产地广东，深圳市康程医药有限公司)。

丹参素(对照品 HPLC≥98.0% 批号 ZY150419)，丹酚酸B(对照品 HPLC≥98.0% 批号 ZY150420)，原儿茶酸(对照品 HPLC≥98.0% 批号 ZY150829)，原儿茶醛(对照品 HPLC≥98.0% 批号 ZY150830)均购自上海谱振生物科技(克拉玛尔®)。乙腈(色谱纯，批号130325，YiRenDa)，甲醇(色谱纯，批号20150623，天津永大化学试剂)，三氟乙酸(分析纯，T818778，Lot#：C10029827，麦克林)

2 方法

2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B的对照品适量，加70%甲醇水溶液制成浓度分别为0.248 3 mg/mL,0.011 49 mg/mL,0.012 77 mg/mL和1.050 mg/mL的混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.2 供试品溶液的制备

取丹参药材约90 g，砂仁约27 g，檀香约27 g，精密称定。先将丹参药材置于煎药壶中，加入750 mL蒸馏水浸泡1 h，煎煮45 min后，加入约13.5 g砂仁和13.5 g檀香继续煎煮15 min。将药液用四层纱布过滤。然后补加600 mL蒸馏水煎煮45 min，将余下的砂仁和檀香加入煎药壶中，补加150 mL蒸馏水继续煎煮15 min，将药液用纱布过滤，合并两次药液，得到丹参饮(3付药的剂量)。然后取5 mL药液至25 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，作为供试品溶液。置于4 ℃冰箱避光保存。

2.3 阴性对照溶液的制备

取处方量的砂仁和檀香，精密称定，照上述供试品溶液的制备方法，得到不含丹参的阴性对照溶液。

2.4 色谱条件与系统适用性

色谱柱：Genmini 5 μm C18110A(250 mm×4.60 mm,5 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.05%三氟乙酸(B)溶液为流动相，梯度洗脱(0～7 min，2%A→10%A;7～20 min,10%A→23%A;20～35 min,23%A→27%A;35～38 min,27%A→38%A),流速0.8 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长288 nm，进样量15 μL。在上述色谱条件下[3]，理论塔板数均不低于2 000，相邻峰之间分离度均大于1.5。混合对照品，阴性对照，精品中药丹参饮和普通中药丹参饮色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、阴性对照品(B)、精品中药丹参饮样品(C)和普通中药丹参饮(D)的高效液相色谱图1.丹参素(danshensu);2.原儿茶酸(protocatechuic acid);3.原儿茶醛(protocatechualdehyde);4.丹酚酸B(salvianolic acid B)

2.5 线性范围

精密吸取混合对照品溶液2、6、8、10、12、16、20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积X对进样质量Y(μg)作图，各对照品物质标准曲线、回归方程、线性范围见表1。

表1 线性关系

2.6 精密度试验

精密吸取丹参饮供试品溶液10 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，测得丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B峰面积相对标准偏差分别为：0.18%、1.35%、1.48%、0.24%。

2.7 专属性试验

精密吸取阴性对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，得到色谱图C，说明处方中的砂仁和檀香不会影响丹参饮中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B的含量测定。

2.8 稳定性试验

分别将丹参饮溶液于0、4、8、12、24、48 h过0.45 μm微孔滤膜(弃初滤液)置于进样小瓶中，精密吸取丹参饮供试品溶液10 μL注入液相色谱仪中，测得48 h内丹参饮样品中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B峰面积相对标准偏差分别为：0.39%、2.33%、3.25%、0.13%。

2.9 加样回收率试验

精密移取已知浓度的丹参饮样品9份，每份2 mL，分别置于5 mL的容量瓶中，再精密移取含丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B 分别为0.248 3 mg/mL,0.011 49 mg/mL，0.012 77 mg/mL和1.050 mg/mL的混合对照品溶液1.6 mL(3份)，2.0 mL(3份)和2.4 mL(3份)，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜。精密吸取20 μL注入液相色谱仪中，各成分平均回收率分别为：100.5%、98.3%、95.7%和89.2%，相对标准偏差分别为：0.57%、1.31%、0.17%、2.12%。

3 结果

取丹参饮精品中药和普通中药，按“2.2”项制备供试品溶液，各3份，按“3”项色谱条件进行HPLC分析，进样量15 μL，记录各化合物的峰面积，根据各化合物的标准曲线，计算出各化合物的浓度，含量=浓度×稀释倍数/样品量。与丹参饮普通中药相比，丹参饮精品中药中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B的含量均增加，结果具有非常显著差异。测定结果见表2和图2。

表2 丹参饮中4中酚酸性成分含量测定结果(mg/mL)

注：与普通中药相比，*P<0.05，**P<0.01

图2 丹参饮精品中药与普通中药的含量比较注：与普通中药相比，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

4.1 复方制剂成呈多样性和复杂性

对于中药复方制剂，在定量指标上选择多指标控制其质量[4]。本研究在相关文献[5-7]的基础上，采用高效液相色谱法同时测定丹参饮中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B的含量。方法简便，专属性强，灵敏度高，为建立丹参饮制剂的质量标准提供参考。同时也可以作为丹参药材、饮片及其复方制剂的质量评价提供标准。

4.2 色谱条件的优化

根据文献[2]，结合试验，以三氟乙酸溶为水相，乙腈为有机相，考察两者梯度洗脱的时间和比例对色谱分离的影响。结果发现在35～38 min内，乙腈比例从27%→38%，对色谱分离效果最佳。色谱峰对称性良好。

4.3 专属性试验

对阴性对照溶液进样分析，在0～40 min内，檀香和砂仁未出现干扰峰。

4.4 加样回收率试验的验证

用混合对照品作为加样的对照品，丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛加样量与样品中的含量接近，测得回收率在95%～105%之间，而丹酚酸B加样量(1.05 mg)与样品量(2.654 mg)相差较大，回收率为89.2%。配制丹参素和丹酚酸B混合对照品，按样品中丹参素和丹酚酸B的80%、100%和120%的加对照品量，测得丹参素和丹酚酸B的平均加样回收率分别为103.6%和97.9%。相对应的RSD(n=9)分别0.96%和0.92%。说明在该方法可行，可靠、可信。

4.5 精品中药的特点

第一安全，第二优质。很多消费者或患者是长期服用中药的，农化残留物无疑会对他们造成健康问题。精品中药在整个供应链上严格把关，产品在种植前要先检验土壤，在收成后也要检验。在工厂加工前要检验，在生产后也要检验。确保在整个过程中没有被污染，有效成分没有丧失。采用科学的管理手段和现代化的检测方法，严格控制精品饮片的有效成分、安全指标，保证精品中药饮片“道地、安全、有效、均一、稳定”，能够“还中医药本色，还中医药尊严”。

4.6 精品中药是现代中医的强大后盾和基础

它不仅将大量的现代科学技术应用在中药材的质量管理上，而且令中药中医的真实价值得到体现。精品中药解除了消费者和患者对药材安全问题的顾虑，放心地长期使用，另一方面保证了疗效，加强了患者对医生的信心。整体而言，确立了中医的权威性和科学性。本实验的结果表明与丹参饮普通中药相比，丹参饮精品中药中四种酚性的含量均明显增加。这有助于阐明本课题组之前的研究——丹参饮精品中药对动脉粥样硬化大鼠降血脂作用好于丹参饮普通中药的原因。

[1] 陈惠，孙朦朦，安然，等.丹参饮在心血管疾病中的应用[J].杏林中医药，2012，33(1):27.

[2] 李环，焦亚斌.丹参饮精品中药与普通中药对动脉粥样硬化模型大鼠药理作用的比较[J].长春中医药大学学报，2014，30(6):980.

[3] 李安平，杨锡，丁永辉.HPLC法同时测定丹参注射液中8种成分[J].兰州大学学报(医学版)，2012，38(3):34-37.

[4] 姜鸿，王光函，张颖，等. HPLC 法测定火绒草中原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸和咖啡酸[J].中成药，2011，33(11):2023-2025.

[5] 王伟，李焱，谢晓梅，等.高效液相色谱法同时测定丹参中4中酚酸类成分的含量[J].药物分析，2010,14(11)：1276-1278.

[6] 李曼玲，冯伟红，康琛，等.丹参药材水溶性成分含量的HPLC法分析[J].中国中医药信息杂志，2008,15(8)：49-51.

[7] 潘英妮，袁丹，符文卫，等.HPLC法测定丹参类注射液中4种水溶性成分含量[J].沈阳药科大学学报，2004,21(3)：196-200.

Determination of Four Phenolic Constituents between Boutique Salvia Decoction and Common Salvia Decoction by High Performance Liquid Chromatograph

XIE Ming-jun, JIAO Ya-bin, LI Huan, LIN Yu-shan

(SchoolofMedicine,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Objective: To establish an high performance liquid charomatography(HPLC) method for simultaneous determination of Danshensu, protocatechuic acid, protocatechualdehyde and salvianolic acid B in Salvia miltiorrhiza decoction, and to study the discrepancy of four phenolic constituents between Boutique salvia decoction and common salvia decoction.Methods:Analysis was performed on a Waters Symmetry C18(4.60 mm×250 mm,5 μm)column with gradient elution of acetonitrile (A)and 0.05% trifluoroacetic acid (B)at the flow rate of 0.8 ml/min.Detection wavelength was 288 nm and column temperature was set at 25℃.Results: Danshensu, protocatechuic acid, protocatechualdehyde and salvianolic acid B had a good linearity in certain ranges,with correlation eoefficientr≤0.999 8.Compared with the common salvia decoction,the contents of Danshensu,salviandic acid B,protocatechualdehyde and protocatechuic acid were increased obviously.Conclusion:This method is simple, accurate with high stability and good repeatability,which is helpful to control the quality of salvia miltiorrhiza decoction.

HPLC; Salvia decoction; Phenolic constituents

2016-09-09

2016-10-27

深圳市未来产业发展专项资金(JCYJ20150324141711654)；深圳市基础研究计划重点项目(JC201005250070A)

谢名君(1992-)，男，硕士研究生，研究方向：动脉粥样硬化炎症反应及其药物防治。

*通讯作者：焦亚斌(1970-),女，博士，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：动脉粥样硬化炎症反应及其药物防治。

R284.1

A

1002-2392(2017)01-0044-03