常用松香酸检查方法的对比分析及在三种中成药中的应用

李安琪,王艳宏,笔雪艳

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150010)

常用松香酸检查方法的对比分析及在三种中成药中的应用

李安琪1,王艳宏1,笔雪艳2*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150010)

目的：通过对松香酸分析和比较，建立可同时检验乳香、没药、沉香、血竭中是否含有松香酸的统一方法，并应用三种中成药对该方法进行验证。方法：采用两种TLC法和三种HPLC法检测以上四味药材中松香酸。结果：TLC法可同时检测沉香、没药中松香酸。HPLC法以乙腈-四氢呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)为流动相，对四味药材中松香酸可同时检测。结论：同时检测乳香、沉香、没药、血竭四味药材中松香酸，TLC法干扰较多，首选HPLC法。

松香酸；薄层色谱法；高效液相法；乳香；没药；沉香；血竭

松香酸为松香的主要成分[1]，据市场调查，乳香、没药、血竭、沉香等药材价格较为昂贵，松香与上述四味药材外观或气味极其相似，近期发现成药中有混入松香代替上述药材的现象，松香酸对人体危害较大，人体服用并吸收松香酸后，会出现先兴奋后麻痹的症状[2]。目前国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法中对松香酸的检查方法较多，本实验欲通过采用TCL和HPLC等方法[3-6]，对不同的检查方法进行讨论及归纳总结，并制定松香酸统一检查方法，以期达到同一方法检验不同品种中松香酸的目的。

1 材料

1.1 仪器

Linomat 5型半自动点样器(瑞士CAMAG公司)；UltiMate 3000型高效液相色谱仪，配有DAD-3000(RS)检测器、Chromeleon7色谱工作站(美国Thermo公司)；AE240型电子天平(瑞士METTLER公司)。SK2510LHC型数控超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

乙腈为色谱纯(美国Honeywell公司)；四氢呋喃、甲酸为分析纯；水为自制纯化水 ；松香酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：(111938-201201)。

1.3 药品

风湿关节炎片(长春银诺克药业，批号：20150103071)； 跌打丸(华佗国药股份有限公司，批号：20140101)；小儿化毒散(2014年国家评价性抽验样品)。乳香由亳州药材总公司提供，没药由毫州市中药饮片厂提供，沉香、血竭由哈尔滨集团世一堂中药饮片有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 松香酸检出限

2.1.1.1 对照品溶液制备

取松香酸10.24 mg，分别制成1.024 mg/mL，0.512 mg/mL，0.204 8 mg/mL，0.061 44 mg/mL，0.030 72 mg/mL的乙醇溶液。

2.1.1.2 结果

方法1吸取上述对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。松香酸在紫外光灯(254 nm)下显相应的荧光淬灭斑点。结果表明，当点样量为5 μL时，检出浓度为0.204 8 mg/mL，检出量为1.024 mg。

方法2吸取上述对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365 nm)下检视。松香酸在日光下显相应棕黄色斑点。紫外光灯(365 nm)下检识显蓝色荧光斑点。结果表明，当点样量为5 μL时，检出浓度为0.204 8 mg/mL，检出量均为1.024 mg。

2.1.2 供试品中松香酸检查

2.1.2.1 供试品溶液的制备

取2.015 7 g沉香，1.069 7 g乳香，1.047 3 g没药，0.218 1 g血竭置锥形瓶中，分别加25 mL乙醇超声20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.1.2.2 加样回收样品的制备

取松香酸10.70 mg，加乙醇定容至10 mL，分别取1 mL溶液至四个锥形瓶中，回收溶液至干，分别取0.405 8 g沉香，0.238 4 g乳香，0.203 0 g没药，0.041 1 g血竭置锥形瓶中，各加5 mL乙醇超声20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.1.2.3 对照品溶液的制备

取松香酸10.70 mg，加适量乙醇溶液制成1.070 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2.4 结果

(1)吸取“2.1.2”项下供试品溶液、对照品溶液和加样回收样品溶液按照“方法1”项下条件实验。结果表明，供试品色谱沉香、没药在与松香酸对照品色谱相应位置，不显相应的荧光淬灭斑点。加样回收样品中，在与松香酸对照品色谱相应位置，显相应的荧光淬灭斑点。乳香、血竭存在背景干扰，不易区分。见图1。

图1 供试品TLC图(254 nm紫外光灯下)1.沉香供试品；2.沉香加样回收样品；3.乳香供试品；4.乳香加样回收样品；5.松香酸对照品；6.没药供试品；7.没药加样回收样品；8.血竭供试品；9.血竭加样回收样品

(2)吸取“2.1.2”项下供试品溶液、对照试剂溶液和加样回收样品溶液按照“方法2”项下条件实验。结果表明，日光、紫外灯光下乳香、没药、血竭，在与对照品相应位置，斑点均较多，不易区分，存在干扰。见图2。

图2 供试品TLC图A.日光下；B.365 nm紫外光灯下；1.沉香供试品；2.沉香加样回收样品；3.乳香供试品；4.乳香加样回收样品；5.松香酸对照品；6.没药供试品；7.没药加样回收样品；8.血竭供试品；9.血竭加样回收样品

2.2 HPLC方法检查

2.2.1 色谱条件

色谱柱： Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；检测波长：241 nm。流速：1.0 mL/min;进样量：10 μL。分别以乙腈-四氢呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)、乙腈-0.1%甲酸(82∶18)、乙腈-0.1%甲酸(75∶25)为流动相。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取松香酸10.70 mg，加适量乙醇制成每1 mL含10.70 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备

乳香、没药分别取薄层鉴别项下的供试品溶液1 mL，加乙醇稀释至20 mL；血竭取薄层鉴别项下的供试品1 mL，加乙醇稀释至10 mL；沉香取薄层鉴别项下的供试品；分别取上述溶液，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。取跌打丸3.158 2 g，加相当于1/2的硅藻土，研匀，取0.308 6 g；取风湿关节炎片除去包衣，研细，取0.212 7 g；取小儿化毒散研细，取0.214 1 g，分别加乙醇20 mL，超声处理20 min，放至室温，上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液为供试品溶液。

2.2.2.3 阴性溶液的制备

取跌打丸原料药材，按处方制得缺沉香、没药、血竭的阴性样品，照“2.2.2.2”项下方法操作，即得。取风湿关节炎片原料药材，按处方制得缺乳香、没药的阴性样品，照“2.2.2.2”项下方法操作，即得。取小儿化毒散原料药材，按处方制得缺乳香、没药的阴性样品，照“2.2.2.2”项下方法操作，即得。

2.2.2.4 阳性溶液的制备

取跌打丸3.160 3 g，加相当于1/2的硅藻土，研匀，取0.305 2 g；取风湿关节炎片除去包衣，研细，取0.214 8 g，分别加“2.2.2.1”项下松香酸溶液2 mL，再加乙醇18 mL，超声处理20 min，放至室温；乳香、没药分别取薄层鉴别项下的加样回收样品溶液1 mL，加乙醇稀释至20 mL；血竭取薄层鉴别项下的加样回收样品1 mL，加乙醇稀释至10 mL；沉香取薄层鉴别项下的加样回收样品，以上溶液均取上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液为阳性对照溶液。

2.2.3 系统适用性试验

分别取“2.2.2”项下供试品溶液、对照品溶液、阴性溶液和阳性溶液各10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以乙腈-四氢呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)为流动相，见图3。

2.2.4 耐用性的考察

分别采用Aglient-TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、TechMate C18-ST(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-四氢呋喃-0.1%甲酸(35：25：40)为流动相，取供试品溶液10 μL，对照试剂溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明色谱图峰形较好且分离度较高，以乙腈-四氢呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)为流动相，采用不同色谱柱效果均较好。

2.2.5 结论

以乙腈-四氢呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)为流动相峰形较好、分离度较高、耐用性较好。在跌打丸、风湿关节炎片、小儿化毒散三种中成药中进行验证，分离度较高，专属性较好。故沉香、没药、乳香、血竭中松香酸可用此方法同时进行检测。以乙腈-0.1%甲酸(75∶25)为流动相，乳香、血竭峰形较好，分离度较高，但其他两味药材分离度较低，可用于乳香、血竭中松香酸的检测。以乙腈-0.1%甲酸(82∶18)为流动相沉香、没药分离度较好，可用于沉香、没药中松香酸的检测。

3 讨论

本文比较了乙醇、石油醚(60～90℃)两种溶剂为提取溶剂，进行超声提取，结果以乙醇超声20 min提取效率最高。

TLC法同时检查乳香、沉香、没药、血竭中松香酸，乳香、血竭存在干扰，故不推荐使用。HPLC法峰形较好，分离度较高，灵敏度较好，故为首选方法。

以乙腈-四氢呋喃-0.1%甲酸(35∶25∶40)为流动相的方法，虽然分离度较高，但出峰时间较长，且四氢呋喃毒性较大，对机器及检测人员伤害较大。可减小四氢呋喃在流动相中的比例，对松香酸的检测进行更多的探索。

本文所用高效液相系统不同，温度、流速的改变，可能对松香酸检测灵敏度、分离度、峰形有影响，故可对实验条件不同对松香酸检测的影响做更深入研究。

[1] 陈安珍，沙启营，单秀明，等.跌打片中松香酸的 HPLC 和 HPLC-MS/MS 检测方法研究[J].中成药，2013,35(9):1940-1942.

[2] 杨芳.麝香接骨胶囊中非法添加松香酸检测方法的建立[J].中国医药指南，2014,12(19):108-110.

[3] 汪杨丽，苏晶，张毅.舒筋活血丸中非法添加物松香酸的检测方法[J].中国现代中药，2015,17(3):244-246.

[4] 孙磊，刘燕，逄瑜,等.西黄丸和活血止痛散中乳香及非法添加松香的薄层色谱鉴别[J].中国药事，2013,27(7):722-724,744.

[5] 张亚双，闵春艳.小活络丸中非法添加松香酸的检查方法研究[J].中成药，2013,35(4):867-869.

[6] 肖聪，饶伟文，钟名诚．没药掺伪品中松香酸的检测方法研究[J].中药材，2012,35 (8):1237-1241.

Comparative Analysis of Commonly used Abietic Acid Inspection Method and the Application of Three Kinds of Traditional Chinese Medicine

LI An-qi1, WANG Yan-hong1, BI Xue-yan2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HeilongjiangDetectionInstituteforFoodandDrugControl,Harbin150010,China)

Objective: To develop one method for abietic acid test in frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis by comparing and analyzing different detection methods of abietic acid. Apply three kinds of traditionnal Chinese medicine to validate the method.Methods: Two TLC methods and three HPLC methods were tested in frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis. Results: One TLC method of abietic acid test could be only used for both aloes and myrrh. But one HPLC method of abietic acid test could be used for frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis. The mobile phase was acetonitrile-tetrahydrofuran-water(containing 0.1% formic acid)(35:25:40). Conclusion: HPLC method is suitable for abietic acid test in frankincense, myrrh, aloes and sanguis draconis.

Abietic acid; TLC; HPLC; Frankincense; Myrrha; Aloes; Sanguis draconis

2016-05-31

2016-09-18

2014年国家药品计划抽验(中央补助地方经费项目)；2014年中成药国家抽验品种掺伪染色物专项课题

李安琪(1992-)，女，硕士，研究方向：中药质量标准化研究。

*通讯作者：笔雪艳(1973-)，女，博士，主任药师，研究方向：中药质量标准化研究。

R284.1

A

1002-2392(2017)01-0047-04