探讨人类白细胞B27检测方法改良及应用价值

王新元 祝靓 许诺

摘要：目的 探讨人类白细胞B27（HLA-B27）检测方法的改进，及其实际应用的可靠性。方法 选择2014年5月～2016年4月门诊及住院患者379例，患者检测人类白细胞B27应用原有方法及改进方法，进行对比试验。记录两种方法检测结果，将检测结果分阴性组、阳性组和不确定组，共三组。对不确定结果由第三方权威检测机构加以确定。结果 两组结果显示，结果阴性组303例，方法学改进前后符合率100%。阳性组63例，方法改进前后符合率100%。不确定组13例，对此13例患者标本，再送至第三方权威检测机构加以确定。结果阳性6例，确定结果与方法改进后完全符合（6例/6例）。阴性7例，确定结果与改进方法学检测结果符合6例，仅有1例不符合（7例/6例）。结论 人类白细胞B27检测方法的改进，在实际工作中具有可操作性，检测结果可靠性好、准确率高，有效提高了人类白细胞B27的临床辅助诊断价值。

关键词：人类白细胞B27；方法学；诊断价值

我们在人类白细胞B27检测中，借助于聚合酶链反应技术[1]。引进的小型仪器及技术，投资较小、特异性高、分辨率高。适应的基层临床诊断的需要。在实际引用技术中，我们进行的预试验，反复论证方法学的科学性及准确性。经过1年多的探索，我们进行了大量对比试验，对于不确定结果送至第三方检测机构进行确定。探索出在人类白细胞B27（HLA-B27）中白细胞提取阶段，就方法学改进，做了以下3点探索及体会。

1 方法学改进

1.1提纯白细胞 DNA离心力改进 HLA-B27中DNA的提取是整个实验成功与否的关键。我们使用不同离心力，反复实验，得到最适合的离心力是3800 rpm/g，同样达到的沉淀白细胞的目的。原来的推荐离心力是8000 rpm/g，在混匀白细胞时候，由于离心力偏高，凝集成块的白细胞团块，在进一步提纯时，难以打散混匀。离心力在3800 rpm/g时，同样可以达到沉淀白细胞的作用，而在下一步打散混匀白细胞团块时，又能较快达到的混匀白细胞的目的。当离心力低于3800rpm/g时，沉淀白细胞的效果不佳。

1.2检测管的改进 由原来连盖式的按压式离心管，改为非连盖式的螺旋帽子带垫圈EP管。连盖式的离心管检测时，由于混匀力度要求，连盖开盖时，经常出现开盖侧漏现象，甚至脱盖现象。造成检测成分量减少、污染及试剂比例成分的改变。影响检测结果，甚至检测结果难以判断。我们引进了螺旋式帽子带垫圈的EP管，为无酶无热原无菌椎形管，由于螺旋式帽子带垫圈，防渗漏、防污染、防止了检测成分的丢失，确保结果的可靠性。

1.3漩涡混匀器的改进 混匀效果直接关系到人类白细胞B27中DNA的提取的效果。我们使用原普通漩涡混匀器，主要是手持检测管进行混匀，手感力度把握不准，混匀时间持续较长，影响了白细胞沉淀物的混匀效果。改用了插入式漩涡混匀器，可把检测管插入振荡孔内，无需手持可长时间、力度均匀地充分混匀，达到实验要求。

2 讨论

2.1 HLA-B27是一种免疫抗原 HLA-B27抗原是一种免疫遗传标志抗原，为显性遗传的。在免疫系统中主要负责细胞间的相互识别，诱导免疫反应和调节免疫应答。HLA-B27分子可以和一些自身肽链结合，形成免疫复合体在自身细胞膜上表达后，能被相应的CD8+T细胞识别，从而导致T细胞对自身靶细胞的杀伤，造成组织变性、器官受损。

2.2 HLA-B27临床诊断价值 目前已知40多种疾病的发生被认为与人体特定的HLA表型有关有关。最典型的是HLA-B27与血清反应为阴性的关节炎疾病的强关联性，主要是强直性脊椎炎（AS）、瑞特（Reiter's）综合症、反应性关节炎等。其发病率分别为90.2%、78.8%、70.2%。HLA-B27阳性的人显示有很高的发病率[2-3]。AS是一种慢性免疫性疾病，病因到目前为止，尚未完全阐明。AS患者多见于青壮年男性，可导致脊柱强直、疼痛，严重者功能丧失，给患者及其家庭带来沉重的负担。多数有遗传、感染、环境等也有较大相关性，尤其是遗传因素。AS是常染色体显性遗传，家庭性是其重要特征。因此，对AS患者来说，进行HLA-B27的诊断能对患者在疑似强直性脊椎炎的确诊有重要帮助，是目前对AS最主要、最有价值的诊断指标。同时，对骨关节有关患者疾病也具有的一定的诊断及鉴别诊断价值。

2.3 HLA-B27检测方法 目前实验室检测HLA-B27方法主要有微量细胞毒法、酶联免疫吸附法、流式细胞仪法等。微量细胞毒法使用设备简单，但敏感性较差；酶联免疫吸附法因抗体效价问题，使其结果重复性不高；流式细胞仪法是目前普遍使用的方法，全自动流式细胞仪[5]，敏感性高，损伤简便，但其高昂的投入，更适合在大型综合性医院。对于普通的医院，我们找到与之相适应的检测方法，服务和方便广大患者。我们引进了经典的白细胞提取，聚合酶链反应（PCR），凝胶电泳技术，仍后在紫外成像仪上观察条带判断结果的技术。

2.4方法学的可行性 随着人们生活水平及健康意识的提高，人们更加关注的自己的身体是否健康。人类白细胞B-27主要人群是骨关节有关患者疾病的诊断及鉴别诊断。主要检测人类是否患有强直性脊椎炎的主要指标[4]。其检测在临床上越来越普及，为此我们引进了多步法检测HLA-B27。即经典的白细胞提取，聚合酶链反应（PCR）[1]，凝胶电泳技术，仍后在紫外成像仪上观察条带判断结果的技术。我们对379例患者人类白细胞B27进行检测。应用原有方法及改进方法，进行对比试验。总符合率高，仅有1例不符合。不符合原因可能与tap酶污染等影响因素有关。

2.5方法学的优化 经典检测方法的优势是结果可靠准确，结果易于观察。缺点是人为提取白细胞DNA，人为因素影响白细胞DNA提取的效果，每一个环节都至关重要。选择近两年来门诊及住院患者379例，应用原有方法及改进方法，检测HLA-B27，对检测结果进行分组分析。分阴性组、阳性组和不确定组，共三组。結果阴性组及阳性组363例，方法学改进前后符合率100%。不确定组13例，经第三方权威检测机构加以确定。仅有一例不符合。通过实验结果的分析比对，方法学的改良，保证了人类白细胞B-27抗原中DNA的提取效果这个关键的环节。确保了人类白细胞B-27的纯度及含量，为PCR扩增提供前提条件，有效提高了人类白细胞B27试验结果的准确性。为临床医生提供更加准确、可靠的检测结果，进一步提高HLA B27了临床辅助诊断价值的可信度。

参考文献：

[1]WANG Ping-jion，SUN Ling-di，MEI Chuan-zhong，et al.Application of PCR-SBT method in HLA-B27detection in AS Patlents[J].Chin J Lab Diagn，November，2015，19：1898-1890.

[2]托娅，张军力.内蒙古地区疑似强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原阳性率观察[J].分子诊断与治疗杂志，2013（05）.

[3]杨霄鹏，惠玲.人类白细胞抗原B27的实验室诊断[J].分子诊断与治疗杂志，2015，7（4）：276-280.

[4]林蔚，肖平，吴祖常.HLA-B2抗原检测在强直性脊柱炎诊断中的意义[J].国标检验医学杂志，2015，36，（2）：371-372.

[5]沈静，张肖，瑜刚，等.SSP-PCR法与流式细胞检测HLA-B27的相关性比较[J].国际检验医学杂志，2014，35（1）：70.

编辑/周芸霏