乳腺癌干细胞BLM、RecQ4蛋白表达变化及意义

鲁媛，葛章文，刘杰麟

(贵州医科大学，贵阳550004)

乳腺癌干细胞BLM、RecQ4蛋白表达变化及意义

鲁媛，葛章文，刘杰麟

(贵州医科大学，贵阳550004)

目的 探讨乳腺癌干细胞BLM、RecQ4蛋白表达变化及其临床意义。方法 采用无血清培养法从乳腺癌MDA-MB-435细胞中分离乳腺癌干细胞(以下称干细胞)，并鉴定。观察MDA-MB-435细胞裸鼠及干细胞成瘤能力，RT-PCR法检测二者ATP结合盒膜转运蛋白G2(ABCG2)mRNA相对表达量，Western blotting法和免疫组化法检测二者BLM、RecQ4蛋白表达。结果 干细胞膜表面CD44+CD24-/low比例明显高于、CD44+CD24+比例明显低于MDA-MA-435细胞(P均<0.05)；两种细胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。裸鼠成瘤实验结果显示，与接种相同密度MDA-MB-435细胞比较，接种干细胞的裸鼠成瘤时间早、肿瘤体积大；干细胞ABCG2 mRNA相对表达量为0.753±0.025，MDA-MB-435细胞为0.563±0.112；两者比较P<0.05。干细胞BLM蛋白表达低、RecQ4蛋白表达高于MDA-MB-435细胞(P均<0.05)。结论 乳腺癌干细胞成瘤能力强；细胞BLM蛋白表达降低、RecQ4蛋白表达升高可能为其机制。

乳腺癌；无血清培养；乳腺癌干细胞；RecQ家族解旋酶

肿瘤干细胞学说认为乳腺癌干细胞是乳腺癌发生、发展的根源[1,2]。RecQ解旋酶是一种DNA解旋酶，人体中存在RecQL、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5五种RecQ解旋酶，BLM、RecQ4突变将会导致相应疾病的发生，患者存在基因型不稳定和癌症易患性等共同特征[3]。2013年9月～2015年7月，本研究观察了乳腺癌干细胞(以下称干细胞)BLM、RecQ4蛋白表达变化，现分析结果并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：乳腺癌MDA-MB-435细胞由法国医学科学研究院陆核教授馈赠。动物：雌性BALB/c系裸鼠18只，SPF级，4～6周龄，体质量16～20 g，合格证号为S1K(黔)2002-0001，购于贵州医科大学动物房。试剂：recombinant Human EGF、Recombinant Human FGF-Basic、B27 Supplement(50×) 均购自美国Peprotech公司，鼠抗人CD24-FITC抗体、兔抗人CD44-PE抗体、同型对照均购自美国eBioscience公司，RecQ4抗体、BLM抗体、RecQ5抗体和β-actin抗体均购自美国Proteintech公司。

1.2 干细胞分离及鉴定

1.2.1 干细胞分离 采用无血清培养法。取对数生长期MDA-MB-435细胞，PBS洗涤细胞2次，吸尽PBS液，加入胰酶消化2～3 min。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培养基中止消化，800～1 000 r/min离心5 min，弃上清。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数。将细胞以2×104个/mL接种至培养瓶，加入含生长因子的无血清DMEM/F12(1∶1)培养基至8～10 mL，放入37 ℃、5% CO2培养箱中悬浮培养。采取半换液法进行培养，当培养基颜色变黄时，进行全换液法培养。悬浮培养3～4周，200倍光镜下观察其生长情况可见：存活下来的MDA-MB-435细胞(简称分离细胞)在完全培养基中贴壁生长，呈长梭形；转入无血清培养基培养后，随着培养时间延长，细胞由梭形变为圆形，呈悬浮生长，并成串形成微球体，细胞数量逐渐增多。

1.2.2 干细胞鉴定 将MDA-MB-435细胞去掉培养基后PBS冲洗2次，胰酶消化细胞。将悬浮细胞移入离心管中，800～1 000 r/min离心5 min，弃上清。将其与1.2.1中的分离细胞采用PBS冲洗2遍，重悬成密度为2×107个/mL的单细胞悬液。各取50 μL单细胞悬液于离心管中，分别加入50 μL PBS混匀，同时设实验管、空白管、同型对照管。实验管中加入5 μL CD44-FITC、0.625 μL CD24-PE，4 ℃避光孵育30 min。PBS冲洗2遍，加入500 μL PBS重悬细胞，制成单细胞悬液。空白管不加入抗体，同型对照管加入同型对照抗体，其余步骤同实验管。采用流式细胞仪检测细胞膜表面CD44 CD24各表型细胞比例，包括CD44-CD24+、CD44-CD24-、CD44 + CD24-/low、CD44+CD24+(其中CD44+CD24-/low为干细胞表面标志物)，实验重复3次。结果显示，分离细胞膜表面CD44+CD24-/low比例明显高于、CD44+CD24+比例明显低于乳腺癌MDA-MB-435细胞(P均<0.05)；两种细胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；见表1。证实分离细胞为干细胞。

表1 MDA-MB-435及分离细胞膜表面CD44CD24各表型细胞比例比较±s)

注：与MDA-MB-435细胞比较，*P<0.05。

1.3 相关指标观察

1.3.1 成瘤能力 参照上述方法将MDA-MB-435细胞和干细胞分别制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数，分别将其密度调整为1×105、1×104、1×103个/mL，4 ℃条件下保存。将18只雌性裸鼠随机分为6组，每组3只。各组均于两侧腋窝分别皮下注射上述密度的MDA-MB-435细胞和干细胞悬液100 μL。接种后将裸鼠送回SPF级饲养室饲养，每天定时观察肿瘤生长情况，记录成瘤时间。每周固定时间采用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径(a)和垂直方向最短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V=0.5ab2，共12周。

1.3.2 ATP结合盒膜转运蛋白G2(ABCG2)mRNA表达 采用RT-PCR法检测。取MDA-MB-435细胞和干细胞分别加入裂解液，用加样器吹打数次，15～30 ℃放置5 min。按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，采用M-MLV第一链合成系统试剂盒逆转录成cDNA。ABCG2上游引物：5′-TTAGGATTGAAGCCAAAGG-3′，下游引物：5′-TAGGCAATTGTGAGGCAATGAG-3′，扩增长度446 bp；以β-actin为内参，上游引物：5′-GTCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游引物：5′-CGTCACACTTCATGATGGAGTT-3′，扩增长度121 bp。PCR反应体系25 μL：上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 2 μL(0. 2 μg)，去离子水补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；70 ℃延伸10 min。采用2%琼脂糖凝胶进行电泳，120 V电泳30 min。凝胶成像仪进行拍照，Image-Pro Plus 6.0软件分析灰度值。以目的基因与β-actin基因扩增产物电泳条带灰度值的比值计算ABCG2 mRNA相对表达量。

1.3.3 BLM、RecQ4蛋白表达 ①Western blotting法：采用蛋白抽提试剂盒提取MDA-MB-435细胞和干细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。配制8% SDS-PAGE、12% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶，浓缩胶电泳80 V，分离胶电泳120 V，当溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。PVDF转膜，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日在室温下脱色摇床上摇动孵育1 h，TBST冲洗3次。加入HRP标记羊抗兔IgG(1∶2 000)，室温下孵育1 h，TBST冲洗3次，进行电泳蛋白条带显影。以Histone H3.1为内参，采用扫描仪将胶片结果进行扫描，凝胶图象处理系统分析灰度值。以目的蛋白和内参蛋白灰度值的比值计算BLM、RecQ4蛋白相对表达量。②免疫组化法：将MDA-MB-43细胞和干细胞用预温的PBS冲洗3次，每次10 min。加入4%多聚甲醛室温固定20～30 min，PBS冲洗3次，每次10 min。采用0.2% TritonX-100透化10 min，加入5%羊血清室温封闭30 min。加入BLM、RecQ5抗体(用1%羊血清稀释)，4 ℃过夜。PBS冲洗3次后加入Cy3标记的山羊抗兔IgG(用1%羊血清稀释)，室温避光孵育30 min。采用PBS冲洗3次，加入1% Hoechst33342(用PBS稀释)，室温避光孵育5 min，PBS冲洗3次，每次10 min。加入抗荧光衰减剂，95%甘油封片。荧光显微镜下拍照，采用Image J软件分析光密度值。

2 结果

2.1 成瘤能力 接种1×105个/mL MDA-MB-435细胞的裸鼠于接种后第36天出现结节，接种1×105、1×104个/mL干细胞的裸鼠分别于接种后第23、30天出现结节，并逐渐增大。接种1×104、1×103个/mL MDA-MB-435细胞和接种1×103个/mL干细胞的裸鼠均未成瘤。与接种相同密度MDA-MB-435细胞比较，接种干细胞的裸鼠成瘤时间早、肿瘤体积大。裸鼠接种不同密度MDA-MB-435细胞和干细胞后1～3周均未成瘤，裸鼠接种MDA-MB-435细胞和干细胞后4～12周成瘤体积比较见表2。

表2 裸鼠接种MDA-MB-435细胞和干细胞后4～12周成瘤体积比较

注：与MDA-MB-435细胞同浓度、同时间比较，*P<0.01。

2.2 ABCG2 mRNA表达 干细胞及MDA-MB-435细胞ABCG2 mRNA相对表达量分别为0.753±0.025、0.563±0.112；两者比较P<0.05。

2.3 BLM、RecQ4蛋白表达 Western blotting法：干细胞及MDA-MB-435细胞BLM蛋白相对表达量分别为0.92±0.01、0.77±0.03，RecQ4蛋白相对表达量分别为0.78±0.01、0.95±0.03，两者比较P均<0.05。免疫组化法：干细胞及MDA-MB-435细胞BLM蛋白表达(光密度值)分别为0.042±0.002、0.032±0.001，RecQ4蛋白表达分别为0.056±0.002、0.076±0.001，两者比较P均<0.05。

3 讨论

朱敬之等[4]在无血清培养基中添加了bFGF、EGF、B27等只维持细胞生存的必需营养物质，发现可使肿瘤干细胞增殖而形成微球体，维持不分化的状态；而非肿瘤干细胞则贴壁生长，最后死亡。本研究采用无血清培养法富集MDA-MB-435细胞中的干细胞，研究结果显示，干细胞CD44+/CD24-/low比例明显高于MDA-MB-435细胞，说明成功从MDA-MB-435细胞中筛选出干细胞。

研究证实，肿瘤干细胞能在裸鼠体内形成完整的恶性肿瘤，并且有与原发肿瘤相似的组织学特性；体内高致瘤性是肿瘤干细胞重要的特性之一。郭崇勇等[5]研究表明，富集的肿瘤干细胞体内成瘤性明显高于乳腺癌MCF-7细胞。本研究裸鼠成瘤实验结果显示，与MDA-MB-435细胞比较，接种同样密度干细胞的裸鼠成瘤时间早、肿瘤体积较大。ABCG2是一种多药耐药基因，均可以作为各种来源干细胞的重要标志物，在肿瘤干细胞的侵袭和转移中扮演重要角色[6]。Hiraga等[7]研究发现，MDA-MB-231细胞中ABCG2 mRNA在侧群细胞的表达明显高于非侧群细胞。本研究结果显示，干细胞ABCG2 mRNA相对表达量明显高于MDA-MB-435细胞。以上说明乳腺癌干细胞具有高成瘤能力和高耐药性。

RecQ解旋酶是一个高度保守的蛋白质家族，在保持基因组的完整性上具有关键作用。Sassi等[8]研究发现，BLM基因突变可能与乳腺癌的发生有关。RecQ4与p53可阻止mtDNA的不稳定性，从而抑制肿瘤的发生[9]。RecQ4被认为与血液恶性肿瘤的发生相关，还可通过与生存素结合而避免乳腺癌细胞凋亡[10]。但不仅RecQ4的突变会导致肿瘤的发生，其过量表达也会引骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌等肿瘤的发生[11,12]。研究表明，RecQ4在乳腺癌细胞中呈高表达，其与生存素结合而抑制乳腺癌细胞的凋亡[13]。Lao等[14]研究表明，在直肠癌组织中BLM和RecQ4表达均增加。本研究Western blotting法和免疫组化法检测结果均显示，干细胞BLM蛋白表达低于MDA-MB-435细胞，RecQ4蛋白表达高于MDA-MB-435细胞。

综上所述，乳腺癌干细胞BLM蛋白表达降低、RecQ4蛋白表达升高，可能与其耐药性和成瘤能力强有关。

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Expression changes and significance of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells

LUYuan,GEZhangwen,LIUJielin

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the expression changes of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells. Methods Breast cancer stem cells were screened from breast cancer MDA-MB-435 cells and were cultured in serum-free medium. The tumorigenicity of breast cancer stem cells and MDA-MB-435 cells was observed by tumor formation in nude mice. The drug resistance gene ATP-binding cassette transporter G2(ABCG2)mRNA of stem cells was detected by RT-PCR. The protein expression of BLM and RecQ4 was detected in breast cancer MDA-MB-435 cells and their stem cells by Western Blotting and fluorescent staining. Results The proportion of surface markers CD44+CD24-/lowin cancer stem cells was significantly higher, but the proportion of membrane surface CD44+CD24+was significantly lower than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). No statistical significance was found in the proportions of cell membrane surface CD44-CD24+and CD44-CD24-between these two kinds of cells (allP<0.05). The mRNA expression of ABCG2 was 0.753±0.025 in stem cells, and it was 0.563±0.112 in the breast cancer MDA-MB-435 cells (P<0.05). Compared with the nude mice inoculated with the same density of MDA-MB-435 cells, the nude mice inoculated with stem cells had an early tumor formation time and a large tumor volume. The BLM protein expression of stem cells was lower and RecQ4 protein expression was higher than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). Conclusion The tumorigenicity is high in breast cancer stem cells, which may be associated with low expression of BLM and high expression of RecQ4 in breast cancer stem cells.

breast carcinoma; serum-free culture; breast cancer stem cells; RecQ family helicases

国家自然科学基金资助项目(81360349)；贵州省优秀科技教育人才省长专项基金资助项目[黔科合字(2006)57号]。

鲁媛(1987-)，女，硕士，研究方向为肿瘤免疫学。E-mail: luyuanuse@163.com

刘杰麟(1963-)，男，教授，硕士生导师，研究方向为临床免疫学。E-mail： liujlin63@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.003

R392.9

A

1002-266X(2017)04-0017-04

2015-02-03)