大鼠下丘神经元钙蛋白酶1表达与水杨酸钠所致听力损害的关系

黄志辉，黄逸慧，陈慧英，韦廷佳，苏纪平，黄玮

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

·基础研究·

大鼠下丘神经元钙蛋白酶1表达与水杨酸钠所致听力损害的关系

黄志辉，黄逸慧，陈慧英，韦廷佳，苏纪平，黄玮

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 探讨下丘神经元钙蛋白酶1表达与水杨酸钠所致听力损害发生的关系。方法 将36只健康SD大鼠随机分为水杨酸钠组及对照组，每组18只。水杨酸钠组腹腔注射水杨酸钠350 mg/kg(50 mg/mL)，对照组腹腔注射等量生理盐水，均连续注射28天。分别于注射前1天、注射1周及注射4周行听性脑干反应测量两组听力阈值，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期以及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波间潜伏期。采用免疫组织化学法检测两组下丘神经元钙蛋白酶1表达。结果 与对照组比较，水杨酸钠组听力阈值增大，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波间潜伏期延长；下丘神经元钙蛋白酶1相对表达量增加(P均<0.01)；随用药时间延长上述指标变化更为明显(P均<0.05)。结论 钙蛋白酶1参与了水杨酸钠导致听力损伤的过程；钙蛋白酶1在下丘神经元表达量可反映听力损伤程度。

听力损伤；水杨酸钠；下丘神经元；钙蛋白酶1；大鼠

水杨酸钠是解热镇痛药阿司匹林的活性成分，临床应用广泛。但其在临床使用过程中常导致耳聋、耳鸣、听力下降。已有研究表明，水杨酸盐可透过血脑屏障，对听觉系统各个部位有直接作用[1,2]，其作用于毛细胞到听皮层等听觉通路各个环节影响听力。下丘是听觉传导中枢的中继站，在声音频率、强度、时间因素及声源定位的分析中均起重要作用，亦是水杨酸盐药物作用的靶点之一。钙蛋白酶(Calpain)是一种细胞内钙依赖的半胱氨酸蛋白水解酶，其中μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶在中枢神经系统广泛存在，参与细胞凋亡、基因表达调控以及多种神经退行性病变等过程。μ-钙蛋白酶较m-钙蛋白酶可在更低浓度Ca2+条件下激活，钙蛋白酶1(Calpain 1)为μ-钙蛋白酶大亚基，是μ-钙蛋白酶激活后主要活性成分。本研究探讨钙蛋白酶在水杨酸钠所致听力损伤发生中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD大鼠，由广西医科大学动物实验中心提供，雌雄不限，体质量200～250 g，听性脑干反应(ABR)测量听力阈值≥40 dB SPL。

1.2 动物分组及处理 选取符合条件的36只健康大鼠，在广西医科大学动物中心SPF级实验动物房适应性饲养1周；将大鼠随机分为水杨酸钠组和对照组，各18只。水杨酸钠组每天腹腔注射水杨酸钠(水杨酸钠用生理盐水配制，浓度为50 mg/mL，按350 mg/kg腹腔注射)，对照组腹腔注射等量生理盐水；共4周。

1.3 ABR检测 两组分别于水杨酸钠注射前1天、注射1周和注射4周时行ABR检测：采用美国产Bio-logic多功能电生理仪。检测前用1%戊巴比妥钠按50 mg/kg腹腔注射麻醉，15 min后将大鼠固定在固定架上，接上电极。刺激声采用roaring click短促音，脉冲宽度0.1 ms，扫描时程10 ms，刺激率为30～50次/s，刺激强度由100 dB SPL到10 dB SPL，以5 dB SPL梯度递减，扬声器距离大鼠测试耳外耳门约1 cm处固定，采集波滤波范围设定为300～3 000 Hz，叠加512次，实验数据记录时以Ⅲ波刚消失时刺激强度作为听力阈值。测量各时期Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期，Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波间潜伏期。

1.4 下丘神经元Calpain 1表达检测 采用免疫组化法。ABR检测完成后采用4%多聚甲醛对大鼠心脏灌注固定，取出下丘，固定48 h脱水透明，石蜡包埋。石蜡切片厚度为4 μm，每张切片脱蜡后用3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性10 min，PBS冲洗后用枸橼酸钠缓冲液高压修复10 min，PBS冲洗，滴加5%BSA封闭15 min，一抗4 ℃过夜后二抗孵育10 min。用新鲜配置的DAB溶液显微镜下显色2～10 min，苏木素复染，自来水返蓝后脱水透明，以中性树脂封片。玻片显微镜照相后用Image-Pro Plus软件对图像进行分析，以阳性细胞染色(细胞质呈棕黄色)的平均积分光密度值(总IOD/总面积)表示抗原的相对表达量。Calpain 1单克隆抗体购于ORIGENE公司，SABC试剂盒及DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

2 结果

2.1 两组听力阈值比较 对照组在注射前1天、注射1周、注射4周不同阶段听力阈值比较差异无统计学意义(F=0.500，P>0.05)；水杨酸钠组不同阶段测听力阈值比较差异有统计学意义(F=106.215，P<0.01)，且不同时点听力阈值两两比较P均<0.01。注射1周、注射4周水杨酸钠组听力阈值均明显高于对照组(P均<0.01)。见表1。

表1 两组听力阈值比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 两组不同时期ABR检测各波潜伏期、波间潜伏期比较 见表2。

表2 两组各波潜伏期、波间潜伏期比较±s)

注：与注射前1天比较，*P<0.05，#P<0.01；与注射1周比较，△P<0.05。

2.3 两组下丘神经元Calpain 1表达比较 对照组在实验不同时期，Calpain 1阳性染色的神经元较少，且染色程度相仿。水杨酸钠组注射前1天阳性染色神经元细胞较少，且染色较浅；注射1周时阳性染色神经元明显增多，染色较注射前1天有所加深；注射4周可见神经元染色较前两者显著的加深；见插页Ⅰ图4。两组注射前1天、注射1周及注射4周Calpain 1相对表达量比较见表3。

表3 两组下丘神经元Calpain 1相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与同组注射前1天比较，△P<0.01；与同组注射1周比较，#P<0.01。

3 讨论

水杨酸钠不仅对外周的耳蜗具有毒性，亦可透过血脑屏障，直接作用于中枢神经系统抑制耳蜗神经信号的传导，还可显著增大下丘、内侧膝状体、大脑皮层等多个部位对声音信号的反应[1]。研究发现，人应用高浓度水杨酸盐后不久即会出现短期耳鸣和听力损害，水杨酸盐通过加强螺旋神经元(SGN)上的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的电流而增强NMDA受体介导的神经冲动；采用NMDA受体阻滞剂美金刚可显著降低水杨酸钠的耳毒性[3]，提示水杨酸钠耳毒性可能与NMDA受体有关，且NMDA受体激活可促进水杨酸钠对SGN的神经毒性，NMDA受体阻滞剂可抑制水杨酸钠神经毒性。此外，水杨酸钠耳毒性是可逆的，短期应用者停药可恢复正常，但长期注射水杨酸钠会永久减少鼠的耳蜗听神经复合动作电位(CAP)和ABR的振幅[2]，可见除NMDA受体以外，水杨酸钠对神经不可逆听力损伤还包含其他损伤通路，导致耳蜗神经元不可逆损伤。

钙蛋白酶是谷氨酸能突触传递的一个下游靶蛋白，主要表达在神经元胞质和突触终端[4～7]。当NMDA受体被激活时，钙离子进入细胞内，可激活钙蛋白酶。钙蛋白酶在细胞凋亡过程中起着关键作用[8]，可通过对Bax蛋白剪切生成促凋亡片段[9]及激活caspase-3和caspase-12等通路参与细胞凋亡途径[10]。钙蛋白酶的激活还参与多种神经退行性病变，如阿尔茨海默病[11]、亨廷顿病[12]等，皆存在钙离子代谢失调以及钙蛋白酶活性异常，最终引起神经元凋亡，在退行性病变中起关键作用。以上研究均说明病理情况下神经元钙离子浓度异常、钙蛋白酶过度激活是导致神经系统功能异常的机制之一。水杨酸钠长期使用引起的听力损害作用机制迄今为止还未明确，有相关报道指出水杨酸钠可增强SGN的NMDA受体电流[13]，并且激活NMDA受体，使神经元内钙离子和花生四烯酸依赖性超氧化物水平增高[14，15]，最终导致螺旋神经节细胞损伤及凋亡。

本研究结果显示，水杨酸钠组注射水杨酸钠过程中，听力阈值明显高于对照组。Liu等[16]对注射水杨酸的大鼠行ABR检测，发现大鼠在多次注射水杨酸钠的情况下，各波波幅下降，且随着注射时间的延长，其ABR反应阈不断上升，各波潜伏期不断延长，本研究结果与其相符。此外从水杨酸钠组Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期变化情况发现，注射水杨酸钠1周时，Ⅰ、Ⅲ潜伏期未发生明显改变，但Ⅴ波明显升高。Ⅴ波主要反映听觉传导中枢下丘电流，推测可能水杨酸钠可能对下丘神经元影响较早且较明显。分析Ⅰ～Ⅲ波间潜伏期结果可发现持续水杨酸钠作用对大鼠听力损害程度随时间延长而增大，但Ⅲ～Ⅴ波间潜伏期测的结果却并非如此，水杨酸钠注射1周时Ⅲ～Ⅴ波间潜伏期明显更长，注射4周时与注射1周比较差异无统计学意义。该结果产生的原因可能由于NMDA受体本身也是Calpain底物[17]，在水杨酸钠促进NMDA受体表达的同时，也被Calpain水解，从而减轻Calpain对神经细胞的损害。本研究结果显示，随着水杨酸钠应用时间的延长，大鼠听力损害逐渐加重，下丘神经元内Calpain 1表达量随之增加，推测听力损害的严重程度可能与神经元内Calpain 1表达呈正相关。Calpain 1是μ-钙蛋白酶大亚基，当钙离子浓度达3～50 μmol/L激活Calpain，水杨酸钠可促进下丘谷氨酸表达增高，并激活NMDA受体，引起钙离子浓度失调最终激活Calpain，损伤神经元。

总之，Calpain 1参与了水杨酸钠导致听力损伤的过程；Calpain 1在下丘神经元表达量可反映听力损伤的程度。

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黄玮(E-mail: 13977166636@139.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.008

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1002-266X(2017)04-0029-03

2016-02-29)