长链非编码RNA H19与肿瘤性疾病关系的研究进展

邱华，单人锋，时军

(南昌大学第一附属医院，南昌 330006)

长链非编码RNA H19与肿瘤性疾病关系的研究进展

邱华，单人锋，时军

(南昌大学第一附属医院，南昌 330006)

H19是最早被证实为具有印记特性的基因之一。研究证实，H19的转录产物长链非编码RNA H19在正常的胚胎发育过程中发挥重要作用，也在肿瘤的发生、发展过程中扮演着促癌或抑癌的双重角色。深入H19表达及调控的基础及临床实验研究，有望不久的将来在肿瘤性疾病的诊断和治疗中开拓一条全新的道路。现就长链非编码RNA H19的抑癌、促癌、基因治疗及化疗抵抗过程中的作用作一综述。

长链非编码RNA；肿瘤性疾病；基因治疗；化疗抵抗

人类基因组计划证实约90%DNA转录的RNA不具有编码蛋白质的功能。这种由基因转录而成，不具有编码蛋白功能的RNA分子被称之为非编码RNA。根据其长度的不同可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA。序列长度在200 bp以上，由RNA聚合酶Ⅱ合成，经加帽、剪接及多聚腺苷酸化等修饰后，由多个外显子拼接而成的，具有类似mRNA的分子结构而没有蛋白质编码功能的非编码RNA通常被称为长链非编码RNA(LncRNA)，而长度在200 bp以下的则被称为短链非编码RNA，其中包括了microRNA、siRNA、tRNA等多种类型[1]。在过去的几十年里，长链非编码RNA一直被认为是不具有生物学功能的分子碎片，是基因组转录的“噪音”。但近年来的研究发现，LncRNA不仅在哺乳动物的进化过程中发挥重要作用，而且可通过X染色体沉默、染色质修饰及基因组印记、转录和转录后调控等多种层面调控基因的表达水平，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移等多种生物学过程[2～4]。H19是目前研究较多、也是较为成熟的一个lncRNA分子，其异常表达可在肿瘤的发生、发展、转移及预后等病理过程中发挥重要作用。现就长链非编码RNA H19的抑癌、促癌、基因治疗及化疗抵抗过程中的作用作一综述。

1 长链非编码RNA H19的表达特点

H19与IGF2在小鼠体内位于第7号染色体，在人体则位于11p15.5，彼此相距90 kb，是第一对被证实为具有印记特性的基因。其中H19表现为父系印记和母系表达，而IGF2则表现为父系表达和母系印记。二者的印记特性均受H19启动子上游4 kb的甲基化差异修饰区(DMR)或印记调控区域(ICR)的调控[5]。H19在物种进化上具有高度保守性，在胚胎发育时期的内胚层、中胚层及其分化而来的组织内高表达，出生后除心脏和骨骼肌外，其他组织内基本不表达，除非在组织损伤修复和应激状态以及肿瘤发生时重新激活表达[6,7]。H19 RNA全长约2.3 kb，有35个小的开放阅读框(0RF)，且具有类似mRNA的5′端帽子结构和3′端多聚腺苷酸尾巴结构，理论上可编码一种包含256个氨基酸分子的蛋白质。但事实上LncRNA仅仅在mRNA水平发挥作用，并不能编码任何蛋白质分子[8]。有研究认为其可通过与甲基化CpG结合域蛋白1(MBD1)结合，通过修饰DMR区域被抑制的组蛋白标记，参与印记基因网络(IGN)中多个基因的表达，进而调节胚胎的生长发育[9]。H19第一个启动子中的高度保守区域编码的miRNA-675分子，可在妊娠后期通过调节Igf1r基因的表达控制胎盘的生长[10]。随着对H19基因的深入研究，越来越多的证据表明H19的异常表达可作为一种致癌因子或抑癌因子，参与多种肿瘤性疾病的发生、发展、侵袭、转移和化疗抵抗等过程。

2 H19的促癌作用

虽然H19最初是因为其具有抑制肿瘤发生的功能而作为一种抑癌基因被提出来的[11]。但近年来的研究发现在某些肿瘤性疾病中H19异常表达，并认为H19在促进肿瘤的发生、发展、侵袭及转移中扮演着重要角色。Zhang等[12]通过实时荧光定量PCR技术对80例胃癌患者H19表达水平检测分析发现，胃癌组织内H19表达水平明显高于癌周正常组织，H19的表达水平与胃癌TNM分期、肿瘤的侵袭深度、淋巴结转移程度具有明显的相关性，且H19的高表达预示着不良的总体生存率。Li等[13]研究认为，H19的异常表达在胃癌细胞的增殖、侵袭和转移过程中扮演着重要角色。H19共表达谱结果显示，H19与其结合蛋白ISM1组成共表达网络；生物信息学分析和荧光素酶报告显示CALN1是miR-675的靶基因，其表达量与miR-675呈负相关，最终认为H19在胃癌中的作用可能通过上调ISM1，以及通过其表达产物miR-675，间接地下调CALN1的表达调控胃癌的发生、发展进程。此外，亦有研究认为H19，可通过抑制抑癌基因P53的表达促进胃癌的发生发展[14]。

从静止不动的上皮细胞向活动的间充质细胞分化是肿瘤进展过程中不可或缺的一步。研究表明，miRNA的异常表达和上皮间质转化及肿瘤的进展有密切联系[15]。Liang等[16]采用实时定量PCR检测SW620细胞和耐甲氨喋呤HT-29细胞在TGF-β1诱发上皮间质转化前后H19的表达水平时发现，TGF-β1处理后的H19表达水平明显增高，提示H19可参与EMT过程。为进一步探究H19参与EMT的分子机制，其功能获得/丧失分析和PCR实验发现，H19可通过与RISC结合解除miR-138对Vimentin的抑制作用和干扰miR-200a对ZEB1、ZEB2的抑制作用，进而促进上皮间质转化的发生。Ma等[17]在对胰导管胰腺癌的侵袭性研究中发现，有转移的胰导管胰腺癌中H19的表达水平明显高于无转移性的胰导管胰腺癌。在接下来的qRT-PCR、划痕实验和Transwell实验中证实，H19可通过对抗let-7对HMGA2的抑制作用，下调E-cadherin的表达，调节PDAC细胞的上皮间质转化，增强细胞的迁移和侵袭能力，促进肿瘤细胞的局部浸润和远处转移。H19在食管鳞状细胞癌[18]、膀胱癌[19]和骨肉瘤[20]等恶性肿瘤中异常高表达的发现，也更加肯定了H19在肿瘤的发生发展过程中的促癌地位。

3 H19的抑癌作用

由于肿瘤组织的来源不同、细胞外微环境的差异、调控H19的上游因子不同和H19激活下游的通路不同，H19既能表现为致癌基因又可表现为抑癌基因[21]。在使用基因芯片杂交技术分析lncRNA基因表达谱时发现，肝细胞癌组织中H19的表达明显低于癌旁正常肝组织[22]。正位异种移植肝细胞癌成瘤实验中，低H19表达可产生更多的肝内转移病灶，并认为其具有更强的侵袭性和转移能力。在沉默H19的表达后，上皮标志物CDH1、KRT-8、KRT-19和CLDN1表达下降，间叶细胞标志物N-黏附素、Snail1、Vementin和Twist1表达升高，认为H19可逆转EMT，抑制肝细胞癌细胞的侵袭转移。随后在肝癌细胞系、SMMC7721以及HCCLM3中进行实验，发现H19与hnRNP U/PCAF/RNA POlII复合物结合，诱发组蛋白乙的乙酰化，进而促进miR-200家族对肿瘤细胞上皮间质转换和细胞移行的抑制[23,24]。抑制或沉默肝细胞癌MHCC-97H细胞系中lncRNA H19和miR-675的表达，细胞的侵袭转移能力增强，同时AKT表达上调，而GSK-3β表达受抑制。而GSK-3β表达下调可延长细胞分裂周期蛋白(Cdc25A)的半衰期，促进细胞增殖及转移。继而认为lncRNA H19和miR-675可通过AKT/GSK-3β/Cdc25A信号通路抑制肝细胞癌的侵袭和转移[25]。Yoshimizu等[26]在对小鼠体内成瘤模型的研究中发现，H19的高表达可延缓畸胎瘤生长速度，减少结肠息肉的生成和推迟肝癌出现的时机。以上实验研究均提示，H19可作为一种抑癌基因参与肿瘤的发生及发展过程。

4 H19与肿瘤的基因治疗

在肿瘤性疾病中，针对于某些异常表达的基因进行临床干预是目前研究的热点。DTA-H19(也被称作为BC-819)是一种携带白喉毒素A(DTA)基因的双链DNA质粒，在肿瘤细胞异常表达的H19基因调控下可表达白喉毒素A，通过抑制蛋白质合成选择性地对肿瘤细胞产生杀伤作用[27]。Scaiewicz等[28]在对小鼠原位和异位胰腺癌模型的研究中发现，DTA-H19质粒载体转染后肿瘤生长的速度明显减缓，原位和异位胰腺癌模型小鼠体内的肿瘤体积较对照组分别减小了50%和75%。实验研究还发现，DTA-H19质粒可抑制小鼠原位胰腺癌的局部浸润和远处转移。在Hanna等[29]的临床试验研究认为，超声内镜或CT引导下瘤内注射BC-819，不仅可通过缩小肿瘤的体积，为晚期胰腺癌患者争取手术机会，还可明显延长患者生存期，是一种安全有效的治疗手段。Mizrahi等[30]对1例晚期卵巢上皮性癌患者采用DTA-H19腹腔灌注冲洗治疗时发现，虽然由于质粒穿透作用的局限性，不能有效缩小肿瘤直径，但却可明显消除癌性腹水，改善患者一般状况，提高患者生活质量。有研究证实，局部的DTA-H19治疗配合系统性的化学治疗可获得较好的疗效[31]。

5 H19与化疗抵抗

目前针对于肿瘤性疾病的治疗仍以手术治疗为主，放化疗为辅。但有时因为缺乏特异性的诊断标志物和典型的临床症状，很大一部分患者在确诊时已处于疾病晚期，失去了手术治疗的机会；此时化放疗是最佳辅助性治疗手段。耐药性是肿瘤化疗获得良好疗效的最大障碍，是导致化疗失败的最常见原因[32]。P-糖蛋白作为ATP转运蛋白家族的一员，其主要作用是将细胞内的化疗药物外排，有效地降低胞内药物浓度，维持细胞的生存和药物耐受，在化疗抵抗过程中发挥重要作用[33]。多方面的证据显示，p-糖蛋白在多种肿瘤中高表达并参与化疗抵抗过程[34]。Tsang等[35]在肝细胞癌耐药性研究中发现，在耐阿霉素的肝细胞癌R-HepG2细胞系中，H19表达水平是非耐药HepG2细胞系的8倍。敲除或沉默H19基因后，HepG2、R-HepG2和Hep3B等肝癌细胞的阿霉素致敏效果显著，阿霉素的半抑制浓度(IC50)明显降低。因而认为，H19可参与肝癌细胞药物敏感性的调节。其中的具体调节分子机制尚不完全清楚,可能与H19调节MDR1基因启动子的甲基化有关。

综上所述，H19无论是在正常胚胎生理过程还是在肿瘤的发生、发展过程中均扮演着重要的角色。由于肿瘤组织的来源不同、细胞外微环境的差异及具体的作用机制不同，H19在各种肿瘤性疾病中发挥的作用亦不同。虽然H19的异常表达与肿瘤性疾病的发生发展、复发转移和化疗抵抗等过程具有明显的相关性，但其具体的作用机制尚不明确。随着细胞分子生物学的发展和基因技术的日渐成熟，以及大样本临床试验研究的深入开展，H19在肿瘤性疾病中的作用及机制必将得到进一步的揭露，H19的基因靶向治疗也将从理论研究和动物实验阶段走向临床运用阶段。在肿瘤中H19基因的异常表达不但可作为肿瘤标志物，用于肿瘤早期筛查和复发的监测，而且可作为靶向治疗药物的作用靶点，为肿瘤的靶向治疗提供一条新思路。

[1] Spizzo R， Almeida MI， Colombatti A， et al. Long non-coding rnas and cancer： anew frontier oftranslational research[J]. Oncogene, 2012,31(43):4577-4587.

[2] Shi X， Sun M， Liu H， et al. Long non-coding RNAs: a new frontier in the study of human diseases[J]. Cancer Lett, 2013,339(2):159-166.

[3] Ernst C， Morton CC. Identification and function of long non-coding RNA[J]. Front Cell Neurosci, 2013,7:168.

[4] Roberts TC， Morris KV， Weinberg MS. Perspectives on the mechanism of transcriptional regulation by long non-coding RNAs[J]. Epigenetics, 2014,9(1):13-20.

[5] Thorvaldsen JL, Duran KL, Bartolomei MS. Deletion of the H19 differentially methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2 [J]. Genes Dev, 1998,12(23):3693-3702.

[6] Gabory A, Jammes H, Dandolo L. The H19 locus: role of an imprinted non-coding RNA in growth and development. Bioessays[J], 2010,32:473-480.

[7] 查巍巍,曹静萍,张迪,等.GDNF在精原干细胞中对H19和A-myb表达的调控研究[J].上海交通大学学报(医学版),2011,31(12):1715-1718,1723.

[8] Zambrano P, Segura-Pacheco B, Perez-Cardenas E, et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes[J]. BMC Cancer, 2005,5:44-52.

[9] Monnier P, Martinet C, Pontis J, et al. H19 lncRNA controls gene expression of the Imprinted Gene Network by recruiting MBD1[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(51):20693-20698.

[10] Keniry A, Oxley D, Monnier P, et al. The H19 lincRNA is a developmental reservoir of miR-675 that suppresses growth and Igf1r[J]. Nat Cell Biol, 2012,14(7):659-665.

[11] Luo M, Li Z, Wang W, et al. Upregulated H19 contributes tobladder cancer cell proliferation by regulating ID2 expression[J]. FEBS J, 2013,280(7):1709-17016.

[12] Zhang EB, Han L, Yin DD, et al. c-Myc-induced, long, noncoding H19 affects cell proliferation and predicts a poor prognosis in patients withgastric cancer[J]. Med Oncol, 2014,31(5):914.

[13] Li H, Yu B, Li J, et al. Overexpression of lncRNA H19 enhances carcinogenesis and metastasis of gastric cancer[J]. Oncotarget, 2014,5(8):2318-2329.

[14] Yang F, Bi J, Xue X, et al. Up-regulated long non-coding RNA H19 contributes to proliferation of gastric cancer cells[J]. FEBS J, 2012,279(17):3159-3165.

[15] Ceppi P, Peter ME. MicroRNAs regulate both epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem cells[J]. Oncogene, 2014,33:269-278.

[16] Liang WC, Fu WM, Wong CW, et al. The lncRNA H19 promotes epithelial to mesenchymal transition by functioning as miRNA sponges in colorectal cancer[J]. Oncotarget, 2015,6(26):22513-22525.

[17] Ma C, Nong K, Zhu H, et al. H19 promotes pancreatic cancer metastasis by derepressing let-7′s suppression on its target HMGA2-mediated EMT[J]. Tumour Biol, 2014,35(9):9163-9169.

[18] Gao T, He B, Pan Y, et al. H19 DMR methylation correlates to the progression of esophageal squamous cell carcinoma through IGF2 imprinting pathway[J]. Clin Transl Oncol, 2014,16(4):410-417.

[19] Luo M, Li Z, Wang W, et al. Long non-coding RNA H19 increases bladder cancer metastasis by associating with EZH2 and inhibiting E-cadherin expression[J]. Cancer Lett, 2013,333(2):213-221.

[20] Li M, Chen H, Zhao Y, et al. H19 Functions as a ceRNA in promoting metastasis through decreasing miR-200s activity in osteosarcoma[J]. DNA Cell Biol, 2016,35(5):235-240.

[21] 邹瑞,林颖,欧阳可雄,等.H19基因在肿瘤发生发展中的作用研究进展[J].实用医学杂志，2015,(19):3256-3258.

[22] Yang F, Zhang L, Huo XS, et al. Long noncoding RNA high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans[J]. Hepatology, 2011,54(5):1679-1689.

[23] Zhang L, Yang F, Yuan JH, et al. Epigenetic activation of the MiR-200 family contributes to H19-mediated metastasis suppression in hepatocellular carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2013,34(3):577-586.

[24] Hung CS, Liu HH, Liu JJ, et al. MicroRNA-200a and -200b mediated hepatocellular carcinoma cell migration through the epithelial to mesenchymal transition markers[J]. Ann Surg Oncol, 2013, Suppl 3:S360-368.

[25] Kang T, Wei Y, Honaker Y, et al. GSK-3 beta targets Cdc25A for ubiquitin-mediated proteolysis, and GSK-3 beta inactivation correlates with Cdc25A overproduction in human cancers[J]. Cancer Cell, 2008,13(1):36-47.

[26] Yoshimizu T, Miroglio A, Ripoche MA, et al. The H19 locus acts in vivo as a tumor suppressor [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(34):12417-12422.

[27] Zhang Y, Schulte W, Pink D, et al. Sensitivity of cancer cells to truncated diphtheria toxin[J]. PLoS One, 2010,5(5):e10498.

[28] Scaiewicz V, Sorin V, Fellig Y, et al. Use of H19 Gene Regulatory Sequences in DNA-Based Therapy for Pancreatic Cancer[J]. J Oncol, 2010,2010:178174.

[29] Hanna N, Ohana P, Konikoff FM, et al. Phase 1/2a, dose-escalation, safety, pharmacokinetic and preliminary efficacy study of intratumoral administration of BC-819 in patients with unresectable pancreatic cancer[J]. Cancer Gene Ther, 2012,19(6):374-381.

[30] Mizrahi A, Czerniak A, Ohana P, et al. Treatment of ovarian cancer ascites by intra-peritoneal injection of diphtheria toxin A chain-H19 vector: a case report[J]. J Med Case Rep, 2010,4:228.

[31] Sorin V, Ohana P, Gallula J, et al. H19-promoter-targeted therapy combined with gemcitabine in the treatment of pancreatic cancer[J]. ISRN Oncol, 2012,2012:351750.

[32] Prasad R, Goffeau A. Yeast ATP-binding cassette transporters conferringmultidrug resistance[J]. Annu Rev Microbiol, 2012,66:39-63.

[33] Shen DY, Zhang W, Zeng X, et al. Inhibition of Wnt/β-catenin signaling downregulates P-glycoprotein and reverses multi-drug resistance of cholangiocarcinoma[J]. Cancer Sci, 2013,104(10):1303-1308.

[34] Liu ZH, He YP, Zhou Y, et al. Establishment and identification of the human multi-drug-resistant cholangiocarcinoma cell line QBC939/ADM[J]. Mol Biol Rep, 2011,38:3075-3082.

[35] Tsang WP, Kwok TT. Riboregulator H19 induction of MDR1-associated drug resistance in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Oncogene, 2007,26(33):4877-48781.

时军(E-mail: sj88694129@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.036

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1002-266X(2017)04-0104-04

2016-05-09)