高血压小鼠心肌肥厚过程中心肌组织Prx-2、8-OHdG蛋白表达变化及意义

王若楠，范玉磊，梁婷婷，耿小番，刘璇，姚程，孙影

(华北理工大学基础医学院，河北唐山063000)

高血压小鼠心肌肥厚过程中心肌组织Prx-2、8-OHdG蛋白表达变化及意义

王若楠，范玉磊，梁婷婷，耿小番，刘璇，姚程，孙影

(华北理工大学基础医学院，河北唐山063000)

目的 探讨高血压小鼠心肌肥厚过程中心肌组织硫氧环蛋白过氧化物酶2(Prx-2)、8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)蛋白表达变化及其意义。方法 将60只雄性C57BL/6N小鼠分为观察组40只和对照组20只，观察组采用两肾一夹(2K1C)法制备高血压心肌肥厚模型，对照组只分离左肾动脉，不放置肾动脉夹。两组分别于术前和术后2、4、8、12周测量尾动脉收缩压；术后2、4、8、12周分别随机选择10只观察组小鼠及5只对照组小鼠处死，计算全心质量指数和左心室质量指数，分别采用免疫印迹法、免疫组化法检测左心室心肌组织Prx-2、8-OHdG蛋白表达；分析观察组术后各时间点Prx-2、8-OHdG蛋白表达的关系。结果 两组术前尾动脉收缩压比较无明显统计学差异(P>0.05)，观察组术后2、4、8、12周尾动脉收缩压、全心质量指数和左心室质量指数均呈升高趋势，且均高于对照组同时间点(P均<0.05)；证实建模成功。观察组术后2、4、8、12周左心室心肌组织Prx-2蛋白相对表达量及8-OHdG蛋白表达均呈升高趋势，且均高于对照组同时间点(P均<0.05)。观察组术后2、4、8、12周左心室心肌组织8-OHdG和Prx-2蛋白表达均呈正相关(r分别为0.95、0.97、0.97和0.95，P均<0.01)。结论 高血压小鼠心肌肥厚过程中左心室心肌组织Prx-2、8-OHdG蛋白表达均升高，二者分别通过抗氧化和促氧化作用参与心肌肥厚的发生与发展。

高血压；硫氧环蛋白过氧化物酶2；8-羟基脱氧鸟嘌呤；心肌肥厚；活性氧；小鼠

心肌肥厚是高血压累及心脏最常见的表现，长期心肌肥厚会导致慢性心力衰竭。研究显示，氧化应激是引起心肌肥厚的重要原因之一[1]。氧化应激是指细胞中促氧化与抗氧化体系之间的平衡失调，促氧化因素增多，导致细胞内稳态紊乱。活性氧(ROS)是促氧化的主要物质，具有强氧化潜能，8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)是ROS攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子形成的产物，是反映ROS水平的可靠标志物[2, 3]。硫氧环蛋白过氧化物酶-2(Prx-2)是一种新型过氧化物酶，其在多种疾病中表达升高，可通过抗氧化作用而减少ROS引起的氧化应激损伤[4, 5]。目前关于Prx-2及8-OHdG在高血压诱导心肌肥厚过程中的表达变化鲜见报道。为此，我们于2013年1月～2015年6月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：60只C57BL/6小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，均为雄性，体质量(22.4±0.8)g。主要试剂及仪器：银质肾动脉夹(内径0.15 mm)购于上海奥旺医疗器械有限公司，Prx-2抗体、8-OHdG抗体均购于英国Abcam公司，小鼠无创血压测量仪购于上海奥尔科特生物科技有限公司，单压力心脏导管购于美国Scisence公司。

1.2 高血压心肌肥厚模型制备 将60只C57BL/6小鼠分为观察组40只和对照组20只。观察组采用两肾一夹(2K1C)法制备高血压高血压心肌肥厚模型：小鼠以1 %戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧位进行固定，于腹正中作一1.5 cm切口，切开腹腔后暴露左肾；钝性分离左肾动脉，银质肾动脉夹钳夹左肾动脉，关闭切口。对照组只分离左肾动脉，不放置肾动脉夹。两组术后均自由进食和饮水。 术前和术后2、4、8、12周采用无创血压仪通过鼠尾动脉袖套法测量两组清醒状态下的尾动脉收缩压。每次尾动脉收缩压测定后分别随机选择观察组10只及对照组5只处死，迅速取出心脏，滤纸吸干水分后称质量，分离左、右心房和左、右心室并称重，计算全心质量指数和左心室质量指数。全心质量指数=全心质量(mg)/体质量(g)，左心室质量指数=左心室质量 (mg)/体质量 (g)。结果显示，两组术前尾动脉收缩压比较无明显统计学差异(P均>0.05)，观察组术后2、4、8、12周尾动脉收缩压均明显高于术前及对照组术后同时间点(P均<0.05)。见表1。观察组术后2、4、8、12周全心质量指数和左心室质量指数均呈升高趋势，且均高于对照组同时间点(P均<0.05)。见表2、3。本研究两组术前尾动脉收缩压比较无明显统计学差异，但观察组术后2、4、8、12周尾动脉收缩压均明显高于术前及对照组术后同时间点；观察组术后2、4、8、12周全心质量指数和左心室质量指数均呈升高趋势，且均高于对照组同时间点。提示高血压心肌肥厚模型制备成功。

表1 两组造模前后尾动脉收缩压比较±s)

注：与同组术前比较，*P<0.05；与对照组同时间点比较，#P<0.05。

表2 两组造模后全心质量指数比较±s)

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

表3 两组造模后左心质量指数比较±s)

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

1.4 相关指标观察

1.4.1 左心室心肌组织Prx-2蛋白表达 采用免疫印迹法。将两组术后2、4、8、12周称重后的左心室心肌组织分为两部分进行冻存，分别用于检测Prx-2和8-OHdG蛋白表达。取其中一部分冻存的左心室心肌组织，加入蛋白裂解液进行裂解，超声波击碎后，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，-70 ℃保存。考马斯亮蓝R-250染色测定蛋白浓度，取50 μg总蛋白进行电泳并转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h；加入Prx-2和GAPDH一抗(1∶10 00稀释)后4 ℃孵育过夜，加入二抗 (1∶3 000稀释)后室温孵育45 min，NBT/BCIP显色剂显色。采用Image J软件扫描并分析蛋白表达条带的灰度值，Prx-2与GAPDH的灰度值比值为Prx-2相对表达量。

1.4.2 左心室心肌组织8-OHdG蛋白表达 采用免疫组化法。将另一部分左心室心肌组织冰冻切片室温晾干后，4 ℃丙酮固定10 min，PBS洗涤。37 ℃10%驴血清封闭1 h，滴加8-OHdG一抗(1∶50稀释)，4 ℃过夜后滴加荧光二抗Dylight549，常温避光1 h后封片。每张切片于400倍光镜下随机选取6个视野，8-OHdG阳性表达呈红色荧光；采用IPP图像软件分析心肌细胞的积分光密度(IOD)值，取平均值。

2 结果

2.1 两组左心室心肌组织Prx-2蛋白相对表达量比较 观察组术后2、4、8、12周左心心肌组织Prx-2蛋白相对表达量均呈升高趋势，且均高于对照组同时间点(P均<0.05)。见表4、图1。

表4 两组手术后左心室心肌组织Prx-2蛋白相对表达量比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

注：1～4为对照组术后2、4、8、12周；5～8:2K1C术后组2、4、8、12周。

图1 两组左心心肌组织Prx-2蛋白曲泳结果

2.2 两组左心室心肌组织8-OHdG蛋白表达比较 观察组术后2、4、8、12周左心心肌组织8-OHdG蛋白表达呈升高趋势，且均高于对照组同时间点(P均<0.05)。见表5。

表5 两组手术后左心室心肌组织8-OHdG蛋白表达比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

2.3 左心室心肌组织8-OHdG与Prx-2表达的关系 Pearson相关分析结果显示，观察组术后2、4、8、12周左心室心肌组织中8-OHdG和Prx-2蛋白表达均呈正相关(r分别为0.95、0.97、0.97和0.95，P均<0.01)。

3 讨论

高血压引起的心脏结构重建主要为左心室肥厚，是心脏对慢性压力和容量超负荷的适应性变化，也是高血压的一种常见的并发症，早期代偿性表现为向心性肥厚，晚期则失代偿表现为离心性肥厚，进而心功能下降，最终导致心力衰竭。

研究表明，动脉粥样硬化小鼠内源性ROS水平增高，并伴有Prx-2高表达；如果Prx-2缺乏，则加重小鼠动脉粥样硬化损伤[15]。Zhao等[16]报道，心脏缺血再灌注小鼠心肌细胞中Prx-2表达减少，ROS表达和心肌细胞凋亡率升高；提高Prx-2表达可降低H2O2水平，并通过抑制caspase 3、9、12和激活Bcl-2途径，减少心肌细胞凋亡，表明Prx-2对ROS引起的心肌细胞损伤具有保护作用。本研究观察组术后2、4、8、12周左心室心肌组织Prx-2蛋白相对表达量呈升高趋势，且均高于对照组同时间点。

在正常生理条件下，机体的抗氧化能力和氧化损伤之间保持着相对的动态平衡，氧化应激产生的ROS能迅速被机体内抗氧化系统清除。但在某些病理情况下，机体抗氧化防御能力下降，受有害刺激时ROS产生增多，就会出现体内ROS产生增加和(或)清除减少，导致ROS在体内蓄积，引发氧化应激导致的组织损伤[7, 8]。碱基配对时8-OHdG与腺嘌呤A配对，导致DNA链G:C→T:A颠换，这种突变难以修复或修复极慢，因此8-OHdG蛋白表达可以反映机体DNA氧化损伤程度，是一个可靠的评价机体DNA氧化损伤和氧化应激状态的标志物[9]。研究表明，在心肌肥厚的发展过程中，心肌细胞耗氧逐渐增加，线粒体氧化磷酸化加强，电子传递链中氧泄漏增多，线粒体内产生大量ROS，如不及时清除则会造成细胞的损伤甚至死亡[10, 11]。本研究观察组术后2、4、8、12周左心室心肌组织8-OHdG蛋白表达呈升高趋势，且均高于对照组同时间点；说明肾性高血压可引起心肌组织ROS产生和清除严重失衡，使ROS在心肌细胞内蓄积，导致氧化应激的发生，直接引起心肌细胞的氧化损伤。病理状态下，增高的ROS作为第二信使传递AngⅡ等细胞外信号，通过激活多种细胞内的级联传递信号和转录因子，诱导心肌肥厚基因的表达，进而促进细胞增殖和心肌肥厚[11, 12]。研究表明，在肿瘤、神经系统等多种疾病中ROS水平增高，相应的Prx-2蛋白表达也上调，发挥其抗氧化作用[13, 14]。本研究观察组术后2、4、8、12周左心室心肌组织中8-OHdG和Prx-2表达均呈正相关。以上提示高血压小鼠心肌肥厚过程中心肌组织ROS表达增加。为降低ROS引起的氧化应激损伤，机体通过高表达Prx-2以清除增多的ROS。

综上所述，高血压小鼠心肌肥厚过程中心肌组织Prx-2、8-OHdG蛋白表达均升高，二者分别通过发挥抗氧化和促氧化作用参与心肌肥厚的发生。

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Expression changes of Prx-2 and 8-OHdG protein in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy

WANGRuonan,FANYulei,LIANGTingting,GENGXiaofan,LIUXuan,YAOCheng,SUNYing

(SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the expression and significance of peroxiredoxin-2 (Prx-2) and 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG) in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy. Methods Sixty male mice were randomly divided into the observation group (n=40) and control group (n=20). Mice in the observation group received 2-kidney1-clip (2K1C) to make the models of mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy, while there was no silver clip in mice of the control group. The systolic blood pressure (SBP) was measured in all mice before the operation, and 2, 4, 8 and 12 weeks after 2K1C. Ten mice in observation group and five mice in the control group were scarified at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery to measure the whole heart quality index and left ventricle quality index. Prx-2 and 8-OHdG protein expression was detected by Western blotting and Immunohistochemistry. And then, we analyzed the correlation between Prx-2 and 8-OHdG. Results No significant difference was found in the preoperative SBP between the control and observation groups (P>0.05). Compared with the control group, SBP, whole heart quality index and left ventricle quality index was increased in the observation group at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery, indicating that the hypertension model was successful (allP<0.05). The expression levels of 8-OHdG and Prx-2 protein in the observation group at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery were significantly higher than those of the control group (allP<0.05), and the expression levels of 8-OHdG and Prx-2 protein was positively correlated with each other (r=0.95, 0.97, 0.97 and 0.95,P<0.05). Conclusion The expression levels of Prx-2 and 8-OHdG in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy are increased, and they participate the occurrence and development of myocardial hypertrophy through oxidation and anti-oxidation.

hypertension; peroxiredoxin-2; 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine; myocardial hypertrophy; reactive oxygen; mice

国家自然科学基金资助项目(81200188)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201410081023)。

王若楠(1992-)，女，研究方向为高血压的发病机制。E-mail: 764024174@qq.com

孙影(1976-)，女，教授，研究方向为高血压的发病机制。E-mail: 1565756268@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.007

R544.1

A

1002-266X(2017)04-0005-04

2015-01-14)