电针三阴交对雌性痴呆模型小鼠HPO轴及学习记忆功能影响的实验研究*

王 婧,秦 卓,翟丽静,游 敏,吴娇娟,李昱颉,任 杰,王 桓,程 凯

(北京中医药大学，北京 100029)

电针三阴交对雌性痴呆模型小鼠HPO轴及学习记忆功能影响的实验研究*

王 婧,秦 卓,翟丽静,游 敏,吴娇娟,李昱颉,任 杰,王 桓,程 凯△

(北京中医药大学，北京 100029)

目的：通过观察电针三阴交对雌性痴呆模型小鼠HPO轴和学习记忆功能的影响，以进一步揭示电针三阴交对阿尔茨海默病的作用。方法：选用9月龄SAMP8雌性小鼠12只随机分为模型组(6只)、电针三阴交组(6只)，选用SAMR1小鼠6只为空白对照组。电针组选取两侧三阴交穴，电针20 min/次，隔日1次，共治疗15次。采用ELISA法检测HPO轴相关激素水平，采用水迷宫法检测学习记忆能力。结果：Morris水迷宫实验:治疗前从第1天到第5天模型组和电针三阴交组逃避潜伏期都高于空白对照组，且存在显著性差异(P<0.01)，模型组和电针三阴交组无明显差异(P>0.05);治疗后电针三阴交组较模型组从第1天和第5天潜逃期明显缩短，其中第1、3和5天存在明显差异(P<0.05)。对HPO轴的影响：与空白对照组相比，模型组卵巢E2水平降低(P<0.05)，垂体中FSH、LH和下丘脑中GnRH水平均升高(P<0.05)，卵巢重量显著降低(P<0.01);与模型组相比，电针三阴交组卵巢E2水平显著升高(P<0.05)，垂体FSH、LH和下丘脑GnRH水平均降低(P<0.05)，卵巢重量升高(P<0.05)。结论：电针三阴交对于9月龄SAMP8雌性小鼠的HPO轴功能以及学习记忆能力起到良性调节的作用。

阿尔茨海默病；电针；SAMP8雌性小鼠；三阴交；下丘脑垂体卵巢轴

阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是老年痴呆中最为常见的一种发病类型，它突出的临床表现体现在记忆功能的衰退，智力的全面下降，精神状态异常以及个体行为失常，是老年的一种常见的退行性神经系统病变。目前阿尔茨海默病是影响老年人生活质量的重要的疾病原因[1]。随着全球人口老龄化严峻，阿尔茨海默病的发病率在逐年升高，年龄一直是AD发病的首要影响因素，但是近年来有学者发现，女性阿尔茨海默病的患病率远高于男性[2-3]。有研究发现经给予雌激素治疗的绝经期妇女，可减少阿尔茨海默病的发病[4-5]。雌激素减少假说是阿尔茨海默病发病机制研究的重点之一[6]。ERT是目前针对女性激素异常导致AD的临床常用疗法，但以雌激素为主的ERT在临床使用及动物研究中出现了较多的副作用和使用的局限性[7-8]。因此探寻既能改善HPO轴功能和提高女性雌激素水平，又减少副作用的手段亟待解决。

三阴交穴为足三阴之交会,属足太阴脾经,是治疗妇科疾病之常用穴位,亦是临床治疗围绝经期综合征的要穴。既往实验研究表明，电针三阴交对围绝经期动物模型的HPO轴相关激素水平具有良性的调节作用[9],对HPO轴的调节可以改善雌激素等相关激素的水平，进而对更年期综合症的临床症状起到改善的作用，并进一步猜想，电针三阴交通过对HPO轴的调节，提高雌激素水平、改善下丘脑功能从而预防或者延缓AD的进程。

本实验选择具有更年期综合征与AD病理特点的9月龄SAMP8雌性小鼠为实验对象[10-11],通过电针三阴交(SP6)，观察其对9月龄SAMP8雌性小鼠HPO轴的调节作用以及行为学的影响，初步讨论电针三阴交穴改善AD学习记忆能力的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

9月龄SAMP8雌性小鼠16只，9月龄SAMR1小鼠8只，体质量(30±5)g，清洁级，由天津中医药大学第一附属医院提供。将动物置于清洁柜中，温度控制在(20±2)℃，湿度为65%，在12 h光照和12 h黑暗的环境下进行饲养，保持自由摄食和饮水。

1.2 主要仪器与试剂

毫针：新杏林针灸针(北京天宇恒科技有限责任公司),规格0.17 mm×7 mm。

仪器：ZK380型低温离心机(德国)；正置olympus显微镜(日本)；LH韩氏穴位神经刺激仪(北京华卫公司)。

试剂：E2、GnRH、FSH、LH酶免试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

2 实验方法

2.1 分组与治疗措施

根据统计设计要求，采用完全随机分组方法，将12只9月龄SAMP8雌性小鼠随机分成两组：模型组(6只)，电针三阴交组(6只)。9月龄SAMR1雌性小鼠作为空白对照组(6只)。

穴位定位和刺法：参照全国高等中医院校规划教材《实验针灸学》中有关实验动物针灸穴位的说明。三阴交穴：小鼠后肢内踝尖直上1.5 mm，胫骨后缘。选用双侧三阴交穴，将毫针向脚掌斜刺2 mm，然后将韩氏电针仪连于毫针针柄上，并加以固定，采用疏密波，频率2/100 Hz，强度以针柄轻微抖动为宜，每次留针20 min。隔日治疗1次，共治疗15次，疗程历时30天，其余各组常规饲养，隔日抓取。

2.2 行为学观察

Morris水迷宫定位航行实验(place navigation):选取各组小鼠作为观察对象，水迷宫，是由图像采集分析系统和不锈钢喷塑圆柱形水池两部分组成。水池直径为10 m，高3.8 m，注入3 m水。在水池中放置一登台平台，高1.5 m。按东南西北4个方位将水池平均划分成4个象限(NE、SE、SW、NW) 。实验时将登陆平台固定于 SE 象限内，不高出水面(水下1.5 cm)，水温稳定在 (25±1)℃。除SE象限外在各象限设置3个入水点，每天测试 3次，连续5天，将动物从入水到寻台成功所需的时间记作逃避潜伏期。每次从不同象限的入水点将动物面向池壁放入水中，记录120 s内小鼠的登台时间，在平台上停留超过2 s则定为登陆成功，若超过120 s未找到平台则登台失败，潜伏期记为120 s，用木棒引导其登陆平台并停留10 s。记录每只连续5天的逃避潜逃期，计算每天潜伏期的平均值，来评价小鼠空间记忆的学习获得能力。

2.3 材料处理

每组随机选取，电子天平称重后快速断头，快速将小鼠脑部取出放置于冰袋上，迅速分离出下丘脑。用木签将垂体从垂体窝中分离出来，于此同时打开小鼠腹腔，取出左侧卵巢。将各组织用滤纸擦拭干净，置于液氮中冷藏，将下丘脑、垂体、卵巢用电子天平称重，分别放入匀浆管中将组织充分研磨，按1:9比例加入生理盐水。将匀浆液移入EP管中,置于低温(4℃)离心机中，以3500 r/min的转速充分离心15 min，取上清液，置于-80℃冰箱中保存，待测。

2.4 指标检测

选用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked imraunosortent assay，ELISA)测定SAMP8及SAMR1小鼠卵巢中的E2含量、下丘脑中GnRH含量以及垂体中LH、FSH含量，指标检测操作完全严格按照试剂盒说明进行。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 水迷宫定位航行实验

治疗前：每组个体内变异示:P=0.000<0.05，说明各组逃避潜伏期随时间的变化趋势有统计学意义。组间变异部分示：P=0.000<0.05，说明分组因素(即干预因素)有影响。从第1天到第5天模型组和三阴交逃避潜伏期都高于空白对照组，且存在显著性差异P<0.01，电针三阴交组与模型组相比无明显变化(P>0.05)，说明痴呆模型成功。见表1、图1。

治疗后：每组个体内变异示:P=0.000<0.05，说明各组逃避潜伏期随时间改变的趋势有统计学意义。组间变异部分示：P=0.000<0.05，说明分组因素有影响。从第1天到第5天电针三阴交组的潜伏期均较模型组缩短，其中第1天、第3天和第5天电针三阴交组较模型组比较潜伏期明显缩短，存在显著差异性(P<0.05)，电针三阴交组虽然潜伏期缩短，但与空白对照组相比潜伏期时间依然延长。见表2、图2。

表1 治疗前各组小鼠学习记忆能力水迷宫逃避潜伏期比较(±s,s)

注：与空白对照组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 治疗后各组小鼠学习记忆能力水迷宫逃避潜伏期比较(±s)

注：与空白对照组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01

图1 治疗前各组Morris水迷宫潜伏期的比较注：与空白对照组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01

图2 治疗后各组Morris水迷宫潜伏期的比较注：与空白对照组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01

3.2 电针三阴交对雌性小鼠HPO轴的影响

3.2.1 电针三阴交对雌性小鼠E2的影响 见表3。与空白对照组比较，模型组卵巢E2明显降低(P<0.05)，电针三阴交组无明显差异(P>0.05)；与模型组比较，电针三阴交组卵巢E2明显升高(P<0.05)。

表3 电针三阴交对雌性小鼠E2的影响(±s)

注：与空白对照组比较,▲P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

3.2.2 电针三阴交对雌性小鼠垂体LH的影响 见表4。与空白对照组比较，模型组垂体LH明显升高(P<0.05)，电针三阴交组升高(P<0.05)；与模型组比较，电针三阴交组垂体LH显著降低(P<0.05)。

表4 电针三阴交对雌性小鼠LH的影响(±s)

注：与空白对照组比较,▲P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

3.2.3 电针三阴交对雌性小鼠垂体FSH的影响 见表5。与空白对照组比较，模型组垂体FSH明显升高(P<0.05)，电针三阴交组无明显差异(P>0.05)；与模型组比较，电针三阴交组FSH明显降低(P<0.05)。

表5 电针三阴交对雌性小鼠FSH的影响(±s)

注：与空白对照组比较,▲P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

3.2.4 电针三阴交对雌性小鼠下丘脑GnRH的影响 见表6。与空白对照组比较，模型组下丘脑GnRH明显升高(P<0.05)，电针三阴交组无明显差异(P>0.05)；与模型组比较，电针三阴交组GnRH明显降低(P<0.05)。

表6 电针三阴交对雌性小鼠GnRH的影响(±s)

注：与空白对照组比较,▲P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

3.3 电针三阴交对雌性小鼠卵巢重量的影响

见表7。与空白对照组比较，模型组卵巢重量明显降低(P<0.01)，电针三阴交组卵巢重量无明显差异(P>0.05)；与模型组比较，电针三阴交组卵巢重量明显升高(P<0.05)。

表7 电针三阴交对卵巢重量的影响(±s)

注：与空白对照组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01;与模型组比较,*P<0.05

4 讨论

阿尔茨海默病是老年痴呆中最为常见的神经退行性疾病，随着女性患AD的发病率逐年升高，寻找针对于女性患阿尔茨海默病的治疗方法以及预防手段愈加受到关注。现代研究认为女性患AD的发病原因与女性在围绝经期过程中体内E2、LH、GnRH等HPO轴相关激素水平变化相关[12-13]，针对HPO轴性激素水平对AD的调节机制还需进一步研究。

本实验选用以中枢学习记忆功能快速衰退为主要特征的SAMP8亚系小鼠为实验对象，以有正常衰老过程的SAMR1亚系为空白对照，本实验水迷宫行为学表明，SAMP8小鼠的学习记忆能力减退较SAMR1小鼠明显，出现提前衰老的特征。既往针刺治疗AD的相关腧穴研究中大多使用百会、大椎、风池等通督脉腧穴为主，鲜有对三阴交单穴对性激素的研究[14]。既往研究证实三阴交可以对围绝经期大鼠及去卵巢大鼠的HPO轴有良性的调节作用[9,15-17]。因此，本次实验选用电针三阴交穴观察对痴呆模型雌性小鼠的HPO轴的调节作用，结果发现电针三阴交能够显著提高SAMP8雌性小鼠卵巢重量及卵巢中E2的水平，降低垂体内FSH、LH及下丘脑中GnRH的水平，说明三阴交有促进卵巢分泌雌激素、抑制下丘脑以及垂体对促性腺激素和促性腺激素释放激素的调节功能，可以对SAMP8雌性小鼠的HPO轴起到良性的调节作用，进而可以改善小鼠的学习认知能力。从三阴交的穴性分析，三阴交穴属足太阴脾经，为足太阴脾经与足厥阴肝经、足少阴肾经3条阴经的交会穴，脾为后天之本，是气血生化之源，脾主中焦,肝肾主下焦，故中下焦之气三阴交一穴可以尽之，具有健脾利湿、祛风活络、活血调经、疏肝益肾之功效。从足三阴入腹循行的部位看，足少阴经“贯脊属肾”，明显位置在会阴部的后方；足厥阴经“循股阴，入毛中，环阴器，抵小腹”，联系会阴部阴器，明显位置较足少阴经靠前；足太阴经“交出厥阴之前,上循膝股内前廉，入腹”,明显较足厥阴经靠前，也就是说足三阴经从3个不同方向抵盆腔阴器，对胞宫功能具有整体性、全面性的调节作用。脑为髓海，肾经贯脊入脑，脑髓是先天肾精所化生，后天脾运化所濡养，肝肾同源，肝经与督脉会于巅，所以三阴交能够补气养血、补益脑髓的功效。从三阴交特定神经节段看，三阴交与子宫和卵巢关系密切[18-19]，提示三阴交可对盆腔以及脑起到直接刺激作用，三阴交通过改善卵巢和下丘脑功能，调整HPO轴功能，从而提高痴呆小鼠的学习记忆能力。

因此，笔者得出结论电针三阴交可能通过调节HPO轴相关激素的作用机制，延缓衰老进而改善AD的学习记忆能力，为预防和治疗AD提供新的治疗思路与方法，进一步补充三阴交穴的主治作用。

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国家自然基金项目，编号:81072768。

王婧(1991-)，女，2014级针灸推拿专业硕士研究生。

△通讯作者：程凯(1971-)，男，教授，硕士研究生导师，从事腧穴特异性的临床与研究。

R246.6

A

1005-0779(2017)01-0042-04

2016-08-05