麒麟菜提取物对HepG2、H22肝癌细胞的抗癌作用及机制研究

全香花，赵园园，崔萌纳，隋忠国

麒麟菜提取物对HepG2、H22肝癌细胞的抗癌作用及机制研究

全香花，赵园园，崔萌纳，隋忠国*

目的 从麒麟菜中提取天然海藻色素糖蛋白(NSPG)，并观察其抗肿瘤作用。方法 应用溶剂浸提法从麒麟菜中提取NSPG，应用IR、UV、液相-质谱法、凝胶色谱法测定NSPG样品的分子量及结构特征等。采用MTT比色法测定NSPG作用后HepG2人肝癌细胞、小鼠H22肝癌细胞的体外活性。结果 本研究建立了常温下从麒麟菜中提取NSPG的方法，并测定其理化性质。人HepG2肝癌细胞体外实验结果显示，50、100 mg/L NSPG组培养48 h的细胞增殖活性分别为0.62±0.02、0.54±0.01，低于空白对照组(0.87±0.01)，差异有统计学意义(P<0.05)；小鼠H22肝癌细胞体外实验结果显示，NSPG对肿瘤细胞的增殖活性随NSPG浓度的升高而逐渐降低，抑制率逐渐升高，低、中剂量组的增殖活性、抑制率与高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NSPG对HepG2人肝癌细胞、小鼠H22肝癌细胞表现出不同程度的肿瘤抑制作用。

天然海藻色素糖蛋白；肝癌细胞；体外抗肿瘤活性

0 引言

天然海藻色素糖蛋白(Natural seaweed pigment glycoprotein，NSPG)是从麒麟菜中提取的一种海藻多糖与藻胆蛋白的天然结合物。藻胆蛋白是红藻和蓝藻等藻类特有的捕光色素蛋白[1]，具有抗肿瘤、抗氧化等生物学功效[2-3]，但由于其含量低、性质不稳定、提取工艺复杂等问题，使其开发、利用受到限制。藻胆蛋白和海藻中的硫酸多糖均具有抗肿瘤作用[4-6]，因此，本研究从麒麟菜中提取了海藻多糖与藻胆蛋白呈天然结合状态的海藻色素糖蛋白，并利用IR、UV、液相-质谱法、凝胶色谱法确定NSPG样品的分子量及结构特征等。本研究采用体外细胞培养的方法，评价了麒麟菜NSPG对HepG2人肝癌细胞、小鼠H22肝癌细胞的肿瘤抑制作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要材料 麒麟菜干品：青岛海隆达生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 浓硫酸(分析纯)，乙醇(分析纯)。紫外分光光度计(TU-1901型)：德国BRUKER公司；红外光谱仪(TENSOR型)：德国BRUKER公司；离心机(TDL-5型)：上海安亭科学仪器厂产品；液相色谱-质谱仪(BrukermaXis UHR-TOF LC型)：德国BRUKER公司；凝胶色谱仪(DAWN HELEOS-Ⅱ与OptilabrEX型，配Waters515HPLC Pump)：美国Wyatt公司；CO2培养箱(BNP-310)：日本TABAI ESPEC 公司；酶标仪：瑞典RosysAnthos公司。RPMI-1640培养基、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清：购自美国Gibco公司；环磷酰胺：购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.1.3 细胞株 人HepG2肝癌细胞株：上海细胞库；小鼠H22肝癌细胞：山东省实验动物中心。

1.2 NSPG的制备与分析

1.2.1 NSPG制备 室温下将洗净的麒麟菜切为0.5～1.0 cm的长条，置于pH 3.0的盐酸溶液中浸提，将上述酸性浸提液进行减压抽滤，收集滤液调节pH值为4.5，再加入3倍体积的95%乙醇，搅拌，放置过夜，析出沉淀，真空抽滤得到滤纸上的沉淀部分，将沉淀分别用无水乙醇、丙酮洗涤，室温干燥，得NSPG(图1)。

图1 NSPG的制备过程

1.2.2 NSPG组成与结构分析 以葡萄糖为标准物质，用硫酸-苯酚法测定NSPG中多糖的含量。以牛血清白蛋白为标准物质，用考马斯亮蓝法测定NSPG中蛋白质的含量。用紫外、红外光谱法测定多糖和蛋白质的特征吸收峰。根据β-消除反应和液-质谱法确定糖苷键的类型，用凝胶色谱分析法测定NSPG的分子量。

1.3 NSPG体外抗肿瘤活性的测定 采用MTT比色法测定海藻色素糖蛋白对HepG2人肝癌细胞、小鼠H22肝癌细胞的抑制率。在无菌条件下，取HepG2人肝癌细胞和小鼠H22肝癌细胞悬液，配成瘤细胞密度为5×105/mL的细胞悬液，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基配制。高、中、低剂量组加入的NSPG浓度分别为100、50、10 mg/L，对照组加入等量双蒸水，每组设3个平行样，每孔加入100 μL。在37 ℃、5%CO2培养箱中HepG2人肝癌细胞培养12、24、48 h，小鼠H22肝癌细胞组培养24 h。

用酶标仪测定在490 nm处的吸光度值A，以此表示各组的细胞增殖活性，并按下列公式计算各组细胞的增殖抑制率(Inhibition rate，IR)。IR(%)=(肿瘤细胞对照组A值-实验组A值)÷细胞对照组A值×100%。采用SPSS 17.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用单因素方差分析和q检验。

2 结果

2.1 NSPG的制备与结构分析 利用等电点沉淀法建立从麒麟菜中提取NSPG的方法，制备足量的实验样品。

NSPG外观为棕红色粉末，溶于水，不溶于乙醇乙醚等有机溶剂，其提取得率为8.3%。经凝胶色谱分析，NSPG相对分子量为213.8 kDa。NSPG紫外光谱分析(图2)其特征吸收峰，得吸收值为1.834，在280 nm处蛋白质的吸收值为0.417，但吸收峰不明显，说明蛋白质的含量较低。用考马斯亮蓝染色法测定麒麟菜NSPG中蛋白质的含量为2.04%，采用苯酚-硫酸法测定麒麟菜NSPG中多糖含量为93.3%。

NSPG红外光谱(图3)显示，1 651 cm-1处有酰胺键的特征吸收。根据1 034 cm-1附近有吸收峰，确定NSPG的糖苷类型为吡喃型。

NSPG经β-消除反应前后紫外吸收有变化，提示NSPG中存在O-连接糖苷键。液-质谱图中(图4)相邻峰m/e有规律递减，各峰之间相差均为115，说明其为天冬氨酸。证明NSPG中N-糖基化出现于“AsnX-Thr/Ser”三肽顺序中的Asn(天冬氨酸)残基的氨基氮上，所以NSPG同时存在N-连接糖苷键。

图2 NSPG紫外光谱图

图3 NSPG红外光谱

2.2 NSPG体外抗肿瘤活性研究

2.2.1 人HepG2肝癌细胞体外实验结果 培养48 h后，50 mg/L NSPG组和100 mg/L NSPG组的细胞增殖活性分别为0.62±0.02、0.54±0.01，较空白对照组(0.87±0.01)降低，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图4 NSPG液相-质谱图

组别只数12h增殖活性(A)抑制率(%)24h增殖活性(A)抑制率(%)48h增殖活性(A)抑制率(%)对照组100.40±0.01—0.55±0.01—0.87±0.01—10mg/L组100.37±0.016.980.51±0.01#7.410.80±0.01*#7.4950mg/L组100.36±0.04*10.970.44±0.01*11.100.62±0.02*#28.11100mg/L组100.34±0.01*14.460.43±0.01*21.880.54±0.01*37.56

注：*与对照组比较，P<0.05；#与100 mg/L组比较，P<0.05

2.2.2 小鼠H22肝癌细胞体外实验结果 由表2可见，高剂量(100 mg/L)NSPG组细胞增殖抑制率为25.87%。不同剂量NSPG对肿瘤细胞的增殖活性随浓度的增加而降低，抑制率依次增高，低、中剂量(10、50 mg/L)组的增殖活性和抑制率与高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)，显示NSPG对肿瘤细胞的增殖活性具有抑制作用，且呈剂量-效应趋势。

表2 不同剂量NSPG对肿瘤细胞增殖活性的影响

注：*与对照组比较，P<0.05；#与高剂量组比较，P<0.05

3 讨论

本研究首次建立了常温下从麒麟菜中提取NSPG的方法，经过对提取样品分析测定，确定NSPG的相对分子量为213.8 kDa，多糖含量为93.3%，蛋白质含量为2.04%。多糖和蛋白质的连接方式为O-连接糖苷键，同时存在N-连接的糖苷键，样品提取得率为8.3%。该方法与传统的单纯提取藻胆蛋白相比，具有提取工艺简便、成本低、产品稳定性高、提取得率高等特点，适于大规模生产。

在对NSPG进行HepG2人肝癌细胞增殖活性影响的体外实验结果显示，50 mg/L和100 mg/L剂量组在12 h、24 h、48 h 时与对照组比较均有显著差异，并且随NSPG浓度增加和作用时间延长，对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用呈增强趋势。与王源等[7]报道藻胆蛋白浓度>30 mg/L时，对SMMC-7721细胞存在抑制作用，且随蛋白浓度增加和作用时间延长呈增强趋势结果一致。小鼠H22肝癌细胞体外实验结果显示，高剂量NSPG组细胞增殖抑制率为25.87%，不同剂量组NSPG对肿瘤细胞增殖活性随浓度的增加依次降低，而抑制率依次增高，且低、中剂量组的增殖活性和抑制率与高剂量组有显著差异，表明NSPG对小鼠H22肝癌细胞的增殖活性具有抑制作用，且呈剂量-效应的趋势。

本研究显示，100 mg/L NSPG对人HepG2肝癌细胞和小鼠H22肝癌细胞的抑制率分别为37.56%和25.87%，高剂量组人HepG2肝癌细胞和小鼠H22肝癌细胞的细胞增殖活性较中、低剂量组显著降低。与王勇等[8]研究结果(藻蛋白对体外培养HeLa细胞的生长有抑制作用，随着藻胆蛋白的剂量从10 mg/L增高至80 mg/L，抑制率逐步提高)一致。

通过对NSPG进行体外抗肿瘤活性测试，证实NSPG对人HepG2肝癌细胞和小鼠H22肝癌细胞具有较好的细胞抑制作用，表明NSPG同样具有藻胆蛋白抑制肿瘤的生物活性特征。同时，NSPG具有提取工艺简单、得率高、稳定性好等特点，适于大规模生产，为藻胆蛋白的开发应用和抗肿瘤药物的筛选提供了一个重要的研究方向，目前进一步的研究仍在进行中。

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Inhibitory effect of eucheuma abstracts on hepatoma HepG2 and H22 cells and its mechanisms

QUAN Xiang-hua,ZHAO Yuan-yuan,CUI Meng-na,SUI Zhong-guo*

(Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China)

Objective To extract the natural seaweed pigment glycoprotein (NSPG) fromEucheuma,and evaluate the anti-tumor activity.Methods NSPG was extracted fromEucheumaby using isoelectric precipitation method,and the molecular weight and structural characteristics were determined by IR,UV,liquid chromatography mass spectrometric method and gel permeation chromatography.The cytotoxicityinvitroof HepG2 cells and H22 cells was assayed by MTT assay.Results The extraction method of NSPG fromEucheumaat room temperature was established and the physiochemical properties were elucidated.The proliferation activation of HepG2 in 50 mg/L NSPG group (0.62±0.02) and 100 mg/L NSPG group (0.54±0.01) were lower than that of control group (0.87±0.01) after being cultured for 48 hinvitro(P<0.05).The proliferation activity of H22 cellsinvitrodecreased gradually with the increase of dosage of NSPG (P<0.05).Conclusion NSPG exhibits different inhibitory activities on HepG2 cells and H22 hepatoma cellsinvitro.

Natural seaweed pigment glycoprotein(NSPG);Hepatoma cells;Anti-tumor activityinvitro

2016-06-06

青岛大学附属医院，青岛 266003

青岛市科技发展资金项目(2014-14-046-SW)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701006

*通信作者