超分子化学用于葛根素分离纯化的研究

王哲彬

超分子化学用于葛根素分离纯化的研究

王哲彬

目的 采用超分子化学原理，建立一种天然产物的分离纯化的方法。方法 采用水提法得到葛根素粗提物，通过与糖精形成超分子复合物，再调节溶液pH值，得到葛根素结晶。结果 葛根素结晶纯度为98.65%，总得率为40.13%。结论 该法操作简单，安全环保，回收率和纯度高，在天然产物分离纯化方面具有良好的应用前景。

葛根素；超分子；分离纯化

0 引言

葛根素化学名为4,7-二羟基-8-β-d-葡萄糖基异黄酮，分子式为C21H20O9，是豆科植物野葛(Puerarialobata)或甘葛藤(Puerariathansonilbenth)的干燥根—葛根(Radixpuerariae)中的主要药效成分，含量约为2.6%。现代药理学研究表明，葛根素具有显著的心血管系统活性[1-3]、改善胰岛素抵抗及降血糖作用[4-5]、抗肿瘤活性[6]、神经保护活性[7]、免疫调节作用[8]等药理活性。药代动力学研究表明，葛根素体内消除较快，难于产生毒副作用[9]。因此，葛根素的新药开发越来越受到研究者的重视，葛根的分离纯化也成为研究的热点之一。

目前葛根素的分离纯化主要有萃取法、盐析法、大孔树脂吸附法[10]、离子交换色谱[11]、配位色谱[12]等方法。但是通过上述方法得到的产品纯度通常不高(最高约93%左右)，若要进行新药开发，还需进行二次纯化；上述方法不可避免地使用有机溶剂，如甲醇等，一方面增加成本，造成环境污染，另一方面也会使产品中有溶剂残留，对后续开发产生不利影响；此外，在分离葛根素时，会造成大孔树脂、离子交换纤维、配位色谱柱等耗材的损耗，进一步增加成本。因此，开发一种既环保、成本低廉，还不涉及有机溶剂的方法，将会大大提升经济效益及应用前景。

本研究采用超分子化学的方法，通过选择适宜配体与葛根素形成超分子复合物，从而改变葛根素的溶解度等理化性质，将葛根素与其他成分分离，进而达到纯化目的。此方法对于葛根素及其他天然药物中的活性成分的分离纯化具有良好的示范意义。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂 葛根(浙江中医药大学中药饮片有限公司，批号：20151008)；葛根素对照品(含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号：110752-201313)；糖精(食品级，山东天力药业有限公司，批号：201412004)；盐酸(天津市新华化学试剂厂)、甲醇(美国TEDIA公司)为色谱纯，无水乙醇(浙江三鹰化学试剂有限公司)为分析纯，所有实验用水为纯化水。

1.2 实验仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪，岛津公司；色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Agilent公司；AB135-S型十万分之一电子分析天平，Mettler Toledo公司；MYP11-2型恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；R-100型旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；V-100型真空泵，瑞士BUCHI公司。

2 方法与结果

2.1 葛根粗提物制备[13]称取葛根药材约300 g，置于5 L三颈烧瓶中，加8倍量75%乙醇溶液，回流2 h，过滤，药渣继续加8倍量无水乙醇，重复回流2次。合并滤液，回收乙醇至原液体积的40%左右，趁热加入浓盐酸20 mL，充分搅拌，过滤，滤液继续回收乙醇至成流浸膏状，减压干燥6 h，即得葛根粗提物。称重，提取物重量为11.1 g，收率为3.7%。

2.2 含量分析方法

2.2.1 色谱条件 参照文献[14]，色谱条件为：以甲醇-水(25∶75)为流动相，检测波长为250 nm，流速为1.0 mL/min，色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，运行时间30 min，进样量10 μL。理论塔板数按葛根素峰计算，不得低于4 000。

2.2.2 样液制备 对照品溶液制备：取葛根素对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成每1 mL含80 mg的溶液，即得；供试品溶液制备(粗提物、葛根素晶体折算葛根素质量后，参照药材方法)：取本品粉末(过三号筛)约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 线性关系考察 以进样量(μg/mL)为横坐标，测定峰面积为纵坐标，作标准曲线。并以最小二乘法计算得回归方程：Y=0.684 5 X+1.006 8，R2=0.999 8，结果显示，进样量在6.25～62.5 μg/mL范围内有良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 按“2.2.1”项色谱条件，取对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6次，结果葛根素峰面积的RSD值为0.16%(n=6)，说明此条件下精密度良好。

2.2.5 准确性试验 精密量取已知含量葛根药材0.1 g，共6份，按“2.2.2”项下供试品制备方法制备供试液，向供试液中加入适量葛根素对照品。在“2.2.1”项色谱条件下，分别进样10μL，进样测定，计算加样回收率，结果葛根素的平均加样回收率为98.9%，RSD为1.96%(n=6)，表明方法准确性良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，在0、4、8、16、24 h分别进样10 μL，记录峰面积，结果葛根素峰面积的RSD值为1.50%(n=6)，说明在25 h内，供试品溶液稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批葛根药材，同时制备5份供试品溶液，各进样10 μL，进样测定，计算得葛根素平均含量为2.61%，RSD为1.25%(n=5)，表明方法重复性良好。

按上述方法测定，葛根素对照品、葛根药材、葛根提取物HPLC含量测定图谱见图1。采用外标法分别计算葛根及葛根提取物中葛根素的含量，结果显示，葛根素含量为2.65%，葛根提取物中葛根素含量为42.16%，转移率为58.87%。

图1 HPLC图谱

2.3 葛根素的分离纯化 葛根素的空间结构见图2a，由图可知，葛根素含有多个羟基氧原子，是形成氢键的理想电子供体，其中酚羟基氧原子电负性大，且周围无大型基团，空间位阻小，利于氢键的形成。因此，认为葛根素可与适合的配体形成超分子复合物。糖精化学名为邻苯甲酰磺酰亚胺，空间结构见图2b。根据文献[15]，糖精是一种优良的共晶形成物(Cocrystal Former，CCF)，易与适宜电子供体形成氢键，从而大大改善活性药物成分(Active pharmaceutical ingredients，API)的溶解性。因此，我们选择糖精与葛根素形成超分子复合物，改变葛根素的溶解度，使之在水中易溶；再通过改变溶液pH值，破坏氢键，使葛根素从复合态变为游离态，控制析晶条件使之析出，达到纯化目的。

图2 空间结构图

将葛根粗提物粉碎，加100 mL水，于磁力搅拌器上搅拌10 min。根据葛根素含量，计算糖精量，使葛根素与糖精化学计量比为1∶1，加入溶液中，继续搅拌10 min，过滤。滤液加热至65 ℃，向滤液中缓缓加入0.1 mol/L的盐酸溶液，至pH为4，室温下冷却并静置12 h，转移至4～10 ℃处，冷藏4 h析晶。过滤，产生的晶体(显微照片见图3)即为葛根素，滤液为母液。结晶用冷水洗涤2～3次，干燥，称重。最后得到葛根素结晶共3.19 g，收率为68.15%，总得率为40.13%。

图3 葛根素晶体显微照片

2.4 葛根素结晶及母液含量分析 取“2.3”项下所得结晶及母液，分别按“2.2”项下含量测定分析方法，制备供试液并测定其中葛根素及糖精含量，HPLC图谱见图4，其中图4a为葛根素晶体HPLC图，图4b为母液HPLC图。可知，葛根素晶体中葛根素含量高于98.65%(面积归一化法)；母液中葛根素含量过低，低于线性范围(<6.25 μg/mL)，不做计算，说明母液中葛根素残留量小，损失率很低；糖精含量为18.63 mg/mL，回收率约为93.95%。

3 讨论

根据超分子化学原理，API与CCF形成超分子是一个自发过程，形成自组装系统[15]。因此，反应过程无需额外供能(如加热等)，仅需搅拌即可。但要求API与CCF的空间结构能够契合，否则即使含有适宜形成氢键的基团也无法形成超分子复合物。

图4 葛根素结晶及母液HPLC图谱

通过形成超分子复合物，可以极大地改变API的理化性质，尤其是溶解度；再通过调节pH破坏氢键，使API变成游离态，从而析出，得到纯品。该法操作简便，制备过程中只涉及毒性极低的乙醇，不涉及其他有机溶剂，无需加热供能，更为绿色环保。并且通过分析，母液中还有大量的糖精(收率为93.95%)，因此，母液可重新用于后续葛根素的纯化，进一步降低成本。此部分工艺需后续研究。

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Supramolecular chemistry used in purification of puerarin

WANG Zhe-bin

(Xiaoshan Hospital of Zhejiang,Hangzhou 311202,China)

Objective To build a method for purification of natur products by supramolecular chemistry.Methods Crude extract of puerarin was prepared through water extraction.Puerarin crystal was purified through forming supramolecular complex with saccharin and adjusting pH of the solution.Results The purification of puerarin crystal was 98.65%,and total yield was 40.13%.Conclusion This method is simple and environmentally with highryield and puri and has extensive prospects on nature products purification.

Puerarin;Supramolecular;Purification

2016-04-09

浙江萧山医院，杭州 萧山 311202

10.14053/j.cnki.ppcr.201701021