萝卜硫素诱导肝癌Huh-6细胞增殖和凋亡

韩玉芳，赵延兵，李 俊，李 理，李勇敢

萝卜硫素(sulforaphane,SFN)是蔬菜中所发现的植物活性物质，可增加正常细胞抵抗外来致癌物的能力，以达到抗癌作用[1]。萝卜硫素通过对细胞癌变起始期阶段的调控，促使癌细胞走向凋亡，抑制肿瘤血管形成和抑制癌细胞转移扩散[2]。本研究就萝卜硫素诱导肝癌Huh-6细胞凋亡的作用进行探讨，为研究萝卜硫素治疗肝癌提供思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料细胞：人源肝癌细胞Huh-6，购自中科院上海细胞生物学研究所。药品与试剂：萝卜硫素纯度99.8%，生产批号2016-02，购于西安昊轩生物科技有限责任公司；四唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；优质胎牛血清(FBS)、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；鼠源β-actin及兔源Ki-67、MMP-2、Bax、Cleave Caspase-3、二抗购自美国CST公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司。仪器：550-酶标仪，美国BIORAD公司。恒温细胞培养箱(型号：3110)与超净工作台(型号：Heraguard ECO)，低温离心机(型号：PICO 17)，美国Thermo公司；电泳仪(型号：DYC-Mini1)、电泳槽(型号：DYC-Mini1)，美国Bio-Rad公司。

1.2MTT法检测萝卜硫素对Huh-6细胞存活率将对数期状态良好的Huh-6细胞以1×104细胞/孔种于96孔板。细胞贴壁后吸去原培养液，然后加含不同浓度(2、5、10、20、30、50、70、100 μM)萝卜硫素培养液200 μL。对照组只加DMEM培养液。继续培养20 h时每孔加入5 mg· mL-1MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，移去原培养液，每孔加入200 μL DMSO并震荡5 min，酶标仪检测每孔的吸光度(A)值。细胞存活率=给药组A值/对照组A值×100%。

1.3AnnexinV-FITC/PI检测Huh-6细胞凋亡将对数期状态良好的Huh-6细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板。细胞贴壁后吸去原培养液，然后加含不同浓度(10、20、30 μM)萝卜硫素培养液2 mL。对照组只加DMEM培养液，培养24 h。按试剂盒说明书收集细胞，然后加入FITC标记的Annexin-V，再加入PI，避光反应5 min后，利用流式细胞仪进行检测。

1.4Transwell小室观察Huh-6细胞侵袭转移能力Huh-6细胞分为对照组与萝卜硫素(20 μM)组，取100 μL细胞悬液加入Transwell小室，下室一般加适量完全培养基，按试剂盒说明书要求培养24 h。取出Transwell小室，吸去孔中培养液，按染色试剂盒说明书步骤进行染色，并于显微镜下观察记数。

1.5免疫细胞化学法检测Ki-67与MMP-2表达细胞分组处理同上，对照组不加药物。培养24 h后，预冷PBS漂洗3～5遍，采用4%中性多聚甲醛固定25～35 min，然后实验方法按免疫组化试剂盒说明书操作。

1.6Westernblot检测目的蛋白的表达将细胞样本进行裂解，从而提取蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度。然后进行SDS-PAGE电泳与转膜，加一抗(兔源Bax、Cleave Caspase-3与β-actin，1∶1 200稀释)，并于4 ℃环境下孵育超过6 h。随后HPR标记的二抗(1∶3 500)室温孵育1 h，最后进行X线片曝光、显影、定影。

2 结果

2.1萝卜硫素对Huh-6细胞增殖的抑制作用MTT检测结果表明，与对照组(100%)相比，不同浓度(0、2、5、10、20、30、50、70、100 μM)萝卜硫素的处理Huh-6细胞24 h，呈浓度依赖性地降低Huh-6细胞的存活率，而增加抑制作用(P<0.05)；2 μM和5 μM 萝卜硫素组Huh-6细胞存活率未降低(P>0.05)，见图1。

①与对照组相比较，P<0.05。图1 不同浓度萝卜硫素对Huh-6细胞存活率的影响

2.2萝卜硫素诱导细胞凋亡Annexin V-FITC/PI结果显示，经(10、20、30 μM)萝卜硫素处理后的Huh-6细胞，细胞存活率分别比对照组明显减少，差异具有统计学意义(均P<0.05)。结果表明，萝卜硫素可以诱导肝癌Huh-6细胞凋亡，见图2。

①与对照组相比较，P<0.05。图2 Annexin V-FITC/PI检测Huh-6细胞凋亡情况

2.3各组Huh-6细胞侵袭与转移能力萝卜硫素组Huh-6细胞经萝卜硫素(20 μM)处理后，与对照组相比，Huh-6细胞侵袭与转移能力均下降，说明萝卜硫素可以抑制Huh-6细胞侵袭与转移，见图3。

图3 Transwell小室观察Huh-6细胞侵袭转移能力(结晶紫染色，×400)

2.4萝卜硫素对Huh-6细胞Ki-67与MMP-2表达Ki-67表达于细胞核中，MMP-2表达于细胞质中，染色阳性信号呈棕黄色。与对照组相比，萝卜硫素组Huh-6细胞Ki-67与MMP-2的表达均减少，呈弱阳性染色，且阳性细胞数明显减少，见图4。

图4 Huh-6细胞Ki-67与MMP-2表达(免疫细胞化学染色，×400)

2.5Bax与CleaveCaspase-3表达与对照组相比，肝癌Huh-6细胞经萝卜硫素处理后，Bax、Cleave Caspase-3蛋白水平增高，结果提示明萝卜硫素可以激活Bax与Caspase-3介导的凋亡通路，从而诱导人肝癌Huh-6细胞死亡，见图5。

A:Huh-6细胞蛋白表达；B:Hub-6细胞蛋白表达灰度值①与对照组比较，P<0.05。Bax：凋亡蛋白；Cleave Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，β-actin：内参。图5 肝癌Huh-6细胞Bax与Cleave Caspase-3蛋白表达

3 讨论

研究发现萝卜硫素衍生物诱导SH-SY5Y细胞S期阻滞、细胞活性氧产生增加，且较萝卜硫素作用明显；萝卜硫素能调节PI3K/Akt途径中凋亡相关蛋白的表达，并可通过PI3K/Akt信号途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡和S期阻滞[8]。慢性阻塞性肺气肿患者的外周血巨噬细胞Toll样受体(TLR4)、髓样分化因子88(My D88)高表达，而萝卜硫素可以降低TLR4、My D88高表达，从而减轻慢阻肺患者的炎症反应[9-10]。朱海鹏[11]观察了萝卜硫素对人前列腺癌LNCa P细胞增殖、周期及凋亡的影响以及IGFBP-3及NF-κB在此过程中的变化，发现萝卜硫素对LNCaP细胞的抑制作用可能与IGFBP-3有关，有研究显示后者可能是通过改变NF-κB的表达发挥作用[12]。

萝卜硫素处理Huh-6细胞24 h，呈浓度依赖性地降低Huh-6细胞的存活率，萝卜硫素处理后的Huh-6细胞，细胞凋亡率明显增加。同时，萝卜硫素可以促进Bax表达，使Caspase-3裂解为发挥功能片段Cleave Caspase-3，从而介导肝癌Huh-6细胞凋亡。Caspase引发的级联反应是细胞死亡过程的关键环节，其激活主要包括线粒体依赖途径和死亡受体介导的信号转导途径，导致细胞死亡[13-15]。Bax通过与Bcl-2B形成同源或异源二聚体来促使细胞走向死亡[16-18]，此时，Bax可与Bcl-2B形成异源二聚体时则抑制细胞凋亡[19-22]。另一方面，肝癌Huh-6细胞经萝卜硫素处理后，细胞侵袭与转移能力均下降，免疫细胞化学结果提示，萝卜硫素可以抑制肝癌细胞增殖与侵袭转移关键蛋白Ki-67与MMP-2的表达，使得细胞增殖能力减小，且细胞侵袭转移的能力下降，进一步促进萝卜硫素诱导的肝癌细胞凋亡。

总之，本研究显示萝卜硫素可诱导肝癌Huh-6细胞增殖和凋亡，抑制其侵袭转移能力。

[1] 王见冬,袁其朋,钱忠明.萝卜硫素研究进展[J].食品与发酵工业,2003,29(2):76-80.

[2] 李小冬,郭贝贝,杨英士,等.萝卜硫素抗癌机理研究进展[J].中药材,2015,38(8):1768-1771.

[3] 任杰,蒋何菲,赵娟,等.萝卜硫素及其衍生物BSFN通过激活PI3K/Akt途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡[J].中国药学杂志,2014,49(20):1813-1819.

[9] 邱贞琴,张华.萝卜硫素对慢阻肺患者TLR4、MyD88以及下游炎性因子的影响分析[J].临床肺科杂志,2016,21(3):407-411.

[10]曾晓丽,刘晓菊,包海荣,等.萝卜硫素对慢性阻塞性肺疾病患者巨噬细胞Toll样受体4/髓样分化因子88信号通路的影响[J].中华结核和呼吸杂志,2014,37(4):250-254.

[11]朱海鹏.萝卜硫素对LNCaP细胞增殖、周期、凋亡及IGFBP-3、NF-κB表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2014,61(6):801-804.

[12]杨高祥,周妍,田华,等. N-乙酰半胱氨酸萝卜硫素通过上调Bak和下调Bcl-2B蛋白表达诱导前列腺癌细胞凋亡[J].山西医科大学学报,2016,47(4):311-314.

[13]秦尤文,王椿.针对凋亡抑制蛋白家族(Caspase抑制物)的肿瘤治疗新策略[J]. 世界临床药物, 2006,27(5):274-277.

[14]Mitupatum T,Aree K,Kittisenachai S,et al mRNA expression of Bax, Bcl-2B,p53,Cathepsin B, Caspase-3 and Caspase-9 in the HepG2 cell line following induction by a novel monoclonal Ab Hep88 mAb:cross-talk for paraptosis and apoptosis[J].Asian Pac J Cancer Prev,2016,17(2):703-712.

[15]Erfani S,Khaksari M,Oryan S,et al.Nampt/PBEF/visfatin exerts neuroprotective effects against ischemia/reperfusion injury via modulation of Bax/Bcl-2B ratio and prevention of Caspase-3 activation[J].J Mol Neurosci,2015,56(1):237-243.

[16]靳雅玲,欧士钰,罗伟生.Bcl-2B、Bax与肝纤维化关系的研究进展[J].临床医学工程,2013,20(1):124-126.

[17]Jin Y,Fan JT,Gu XL,et al.Neuroprotective activity of cerebrosides from typhonium giganteum by regulating Caspase-3 and Bax/Bcl-2B signaling pathways in PC12 cells[J].J Nat Prod,2017,80(6):1734-1741.

[18]Zhang S,Qin F,Yang L,et al.Nucleophosmin mutations induce chemosensitivity in THP-1 leukemia cells by suppressing NF-kappaB activity and regulating Bax/Bcl-2B expression[J].J Cancer,2016,7(15):2270-2279.

[19]王卫东,陈正堂.Bcl-2B/Bax比率与细胞“命运”[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2007,14(4):393-396.

[20]Sitarek P,Skala E,Toma M,et al.A preliminary study of apoptosis induction in glioma cells via alteration of the Bax/Bcl-2B-p53 axis by transformed and non-transformed root extracts of Leonurus sibiricus L[J].Tumour Biol,2016,37(7):8753-8764.

[21]Peng X,Chen K,Chen J,et al.Aflatoxin B1 affects apoptosis and expression of Bax,Bcl-2B,and Caspase-3 in thymus and bursa of fabricius in broiler chickens[J].Environ Toxicol,2016,31(9):1113-1120.

[22]Xu G,Kuang G,Jiang W,et al. Polydatin promotes apoptosis through upregulation the ratio of Bax/Bcl-2B and inhibits proliferation by attenuating the beta-catenin signaling in human osteosarcoma cells[J].Am J Transl Res,2016,8(2):922-931.