多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用

李恩泽，刘月芬，刘玉君，姜山

（青岛大学附属医院，山东 青岛 266003）

目前，药品生产过程中总会存在微生物污染情况，而微生物的污染很容易对药品临床使用功效产生不良影响，因为经济水平发展和医疗技术的限制，药品生产过程到目前为止都是采用空气中的浮游菌和沉降菌数量多少作为评判是否安全合格的标准[1-3]，而这一标准显然存在较大的缺陷，即该标准无法对微生物污染进行源头查找和污染控制。随着生物学融入分子学的交叉发展，微生物的鉴定方法得到了大力发展，而新一代的测序技术在临床药品环境微生物鉴定工作中的运用推广，也使得微生物分析工作进入到一个新的领域。基于此，我院开展本次研究工作，以期探讨多重测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用可行性和可靠性，为今后医疗界对环境微生物污染工作的开展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

数码摄影生物显微镜、全自动微生物生化仪、全自动革兰氏染色仪、梯度96孔Verti PCR仪和全自动微生物基因分析鉴定系统[4-5]。

1.2 菌株来源

本次研究在持续不断的12个月中对我院微生物实验室环境中不同位置、研究员、实验设备采用胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板，通过3种方式进行微生物样本采集工作，这3种方式分别是：接触碟法、空气沉降法及擦拭法。本次研究在12个月中共获得10株细菌和11株霉菌，对所有采集到的标本均进行纯化保存，保证标本没有相互污染。

1.3 研究方法

1.3.1 生化鉴定采用VITEK 2 Compact仪器对分离纯化获得的10株细菌开展常规生化鉴定工作，如革兰染色镜检、鉴定试剂卡等鉴定方法，各鉴定过程均严格按照程序及仪器操作说明书操作。

1.3.2 一代测序技术的鉴定参照“1.3.1”项下生化鉴定结果对各菌株来源DNA进行PCR扩增鉴定。严格按照基因分析鉴定系统配套的试剂和操作程序对菌株进行DNA提取、扩增、纯化等操作，并结合电泳测序结果比对数据库进行各菌株的种、属鉴定。

1.3.3 宏基因组测序鉴定宏基因组测序依托高通量测序平台进行宏基因的建库及信息分析，并对鉴定结果进行数据库比对，以证实鉴定数据的真实性。

选择10株细菌和11株霉菌，并采用上述3种方法进行种属鉴定，并对3种方法鉴定结果进行统计学分析，以判定该鉴定方法的可靠性。

2 结果

2.1 10种细菌的种属鉴定

10株细菌的一代测序鉴定与生化鉴定比较，属水平分类一致的有4株，种水平分类一致的有4株。采用宏基因组对各菌株进行全基因组测序鉴定，共获得了10株菌的信息，与一代测序相比，种水平一致的有5株，属水平一致的有5株，多了5株菌的信息。见表1

2.2 11株霉菌的种属鉴定

由表2可以看出，霉菌生化鉴定获得5株菌信息，一代测序获得了4株菌信息，与生化鉴定结果比较，缺失了1株菌的信息；宏基因组测序结果包含8属和11种，8属覆盖了霉菌生化鉴定结果中的5株菌和一代测序的4株菌的信息，种水平全部覆盖。

表1 一代测序鉴定与生化鉴定、宏基因组测序结果比较

表2 霉菌的一代测序鉴定和两种宏基因组测序鉴定结果比较

3 讨论

针对目前的药物生产技术，药品在进行生产的过程中或多或少会出现微生物污染的情况，严重影响药品的质量，如果患者服用污染后的药品，不仅达不到治疗的效果，还会产生严重的并发症，对患者的生命安全形成威胁，因此，针对药品的质量检测非常的重要[5-6]。受医疗技术的限制，药品生产过程都是采用空气中的浮游菌和沉降菌数量多少作为评判是否安全合格的标准[7]，这一标准存在很大的缺陷，随着生物学融入分子学的交叉发展，微生物的鉴定方法得到了大力发展，而新一代的测序技术在临床药品环境微生物鉴定工作中的运用推广，也使得微生物分析工作进入到一个新的领域[8]。

研究发现，生化鉴定的操作较一代测序和宏基因组测序简单，但整体流程复杂，且鉴定结果简单，只能鉴定一些具有明显特异性种属的菌株，而对非特异性种属的菌株则无法鉴定。一代测序的明显优势就是能明确菌株的基因序列，但不能完全实现对菌株种属特异性基因的区分和鉴定，甚至对种属鉴定的特异性低于常规生化鉴定。正如研究结果显示，一代测序在对部分细菌和霉菌种属鉴定过程中，菌株种属的鉴定信息少于生化鉴定信息。宏基因组测序是最新一代的基因测序法，该方法不但能实现对菌株基因序列的鉴定，还能区分大部分菌株的特异性基因序列，实现对未知菌株的精确区分。从研究结果来看，宏基因组测序法能对收集到的全部细菌进行种属鉴定，对全部霉菌的种进行区分，但对部分霉菌的属尚无法完成鉴定区分。究其原因可能有以下几个方面：首先是菌株污染，菌株收集后的存放过程可能导致微量污染，在提取菌株基因后扩增时产生较多非特异性片段，致使无法确定特异性基因序列；其次，特异性基因序列多样性，菌株各种属鉴定时需要明确扩增片段的基因序列，每次扩增只能实现一个片段的富集，对多种特异性片段的种属则无法实现；第三，菌株基因提取纯度不高，即未能富集纯化菌株基因，非纯化的基因在经过多次扩增后产生非特异性片段，对结果的鉴定产生干扰。

综上所述，宏基因组测序能实现对菌株种属信息的准确区分、鉴定；常规生化可鉴定特异性种属的菌株，但对种属特异性不高的菌株鉴定尚显不足；一代测序可实现菌株的基因测序，但对种属的特异性区分能力低于生化鉴定。

[1] 郑小玲,王知坚,李珏,等.多种测序技术在药品检测环境微生物鉴定分析中的应用研究[J].药物分析杂志,2016,36(1):46-52.

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