西罗莫司和环孢素对常染色体隐性遗传性多囊肾病大鼠疾病进展过程的影响*

王 硕 宋一萌 侯小飞 陆 敏 沈伟伟 吴 敏 李由昭 马潞林

(北京大学第三医院泌尿外科，北京 100083)

·实验研究·

西罗莫司和环孢素对常染色体隐性遗传性多囊肾病大鼠疾病进展过程的影响*

王 硕 宋一萌 侯小飞**陆 敏①沈伟伟②吴 敏③李由昭 马潞林

(北京大学第三医院泌尿外科，北京 100083)

目的 观察西罗莫司和环孢素(cyclosporin,CsA)对常染色体隐性遗传性多囊肾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD) 大鼠疾病进程的影响。 方法 20只4周龄ARPKD模型PCK大鼠，雌雄各半，采用成组设计随机分为西罗莫司组(n=6)、环孢素组(n=8)和对照组(n=6)，分别每天以西罗莫司稀释液、环孢素稀释液和无药物的饮用水灌胃，每周测体重，分别于4、6、8、10周龄内眦静脉取血监测肾功能，分别在4、8、12周龄行双肾超声观察囊肿数量及大小，12周龄时全部处死，取双肾称重，并行切片HE染色观察囊肿体积密度(cyst volume density，CVD)。 结果 3组大鼠实验过程中均无死亡，体重均增加，但3组间无显著差异(P>0.05)。12周龄时西罗莫司组超声下肾脏体积、肾脏内囊肿数和最大囊肿最大截面面积均明显低于对照组[(1.65±0.25)cm3vs. (2.00±0.36) m3，q=3.426，P<0.05；(31.75±6.57)个 vs.(43.08±10.28)个，q=3.638，P<0.05；(0.0828±0.0420)cm2vs. (0.1373±0.0536)cm2，q=3.966，P<0.05]；环孢素组超声下肾脏体积、肾脏内囊肿数和最大囊肿最大截面面积与对照组无显著差异(P>0.05)。西罗莫司组、环孢素组和对照组在双肾质量、双肾质量/体重比(2-kidney/total body weight ratio，2K/TBW)、10周龄时血清BUN和Cr以及CVD均无显著差异(P>0.05)。结论 西罗莫司和CsA对PKD大鼠疾病的进程未表现出明显的影响。

常染色体隐性遗传性多囊肾病； PCK大鼠； 西罗莫司； 环孢素； 雌二醇

多囊肾病(polycystic kidney disease, PKD)是一组常见的单基因遗传病，根据遗传方式不同，可分为常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)和常染色体隐性遗传性多囊肾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD )。ADPKD多在成年后发病，发病率为1/1000～1/400；ARPKD多见于婴儿和儿童，发病率在1/40 000～1/20 000[1]，多数早年夭折，很少存活至成年，且常伴有先天性肝纤维化的为主的肝功能损害。目前认为ADPKD大致分为2型，致病基因分别为PKD1基因和PKD2基因，分别产生多囊蛋白-1和多囊蛋白-2；而ARPKD的致病基因为PKHD1基因，该基因编码一种分布广泛的膜内在蛋白(fibrocystin/polyductin，FPC)[2]。相较于ADPKD，有关ARPKD的研究很少。与ADPKD一样，目前尚无有效治疗方法，往往进展到终末期肾病需要长期透析或肾移植。

既往ADPKD研究所用的动物模型，多为Han: SPRD大鼠模型，是目前研究PKD方面了解和应用最多的动物模型，其疾病特征与人类ADPKD相似，但是尚未明确发现类似PKD1或PKD2基因的同源基因。对于ARPKD，常用的是PCK(polycystic kidney)大鼠，它因存在点突变(IVS35-2A→T)，导致翻译过程中跳过外显子36并发生一次移码突变，最终形成一个人类PKHD1基因的同源基因，也即Pck基因[3]，使其成为一个优秀的人类ARPKD模型[4，5]。

西罗莫司(sirolimus)是一种肾移植术后常用的免疫抑制剂，属哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制剂，被报道为有抑制Han: SPRD大鼠的肾小管上皮细胞异常增殖作用，从而可以减缓疾病的发展[6，7]。环孢素(cyclosporin A，CsA)同样是一种肾移植术后常用免疫抑制剂，属钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor, CNI)，对于某些细胞亦具有一定的抑制增殖作用[8～10]。因ARPKD相关的肝纤维化进展为终末期肝病而进行肝移植后，多囊肾引起的症状如腰痛、血尿、高血压等有所改善，考虑与免疫抑制剂环孢素可能有关[11]。本实验探讨西罗莫司和CsA对PCK大鼠疾病进程的影响，为ARPKD的药物治疗探索方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

PCK大鼠购自美国Charles River公司，北京大学医学部实验动物科学部清洁级动物房饲养、繁殖。实验流程经北京大学医学部伦理委员会认可。大鼠自由无限制摄食标准鼠粮和水。

1.2 实验药品

西罗莫司口服液(赛莫司)购自杭州中美华东制药有限公司，规格为50 ml∶50 mg。CsA注射液(山地明)购自北京诺华制药有限公司，规格为5 ml∶250 mg。

1.3 动物分组与处理

取20只4周龄PCK大鼠，10只雄性大鼠(体重161～196 g，平均182.0 g)、10只雌性大鼠(体重161～196 g，平均152.2 g)，随机分成西罗莫司组(n=6)、环孢素组(n=8)和对照组(n=6)，雌雄各半。称体重、眼眶静脉取血测BUN、Cr。为保证灌胃药品体积一致，将西罗莫司口服液用大鼠饮用水稀释至1 ml∶0.2 mg，将CsA注射液用大鼠饮用水稀释至1 ml∶5 mg。然后西罗莫司组按0.2 mg·kg-1·d-1剂量每天灌胃西罗莫司溶液1次；环孢素组按5 mg·kg-1·d-1剂量每天灌胃CsA溶液1次；对照组按1 mg·kg-1·d-1每天灌胃大鼠饮用水1次。 观查大鼠生存状况，每1周重复测体重，每2周(4、6、8、10周龄)眼眶取血1次测血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)，每4周注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，行双肾超声检查，记录每只大鼠双肾的长径、横径及矢状径，可探及的囊肿数，最大囊肿的长径和短径。12周龄时全部处死，注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠，取出双肾去除肾脏包膜，称量双肾质量，为减少体重差异的影响，计算并比较双肾质量/体重比(2K/TBW)。大鼠肾组织切片经4 %磷酸缓冲多聚甲醛溶液固定，乙醇系列脱水，并包埋在石蜡中，备组织学观察用。

1.4 超声检查

2D超声检查均在我院超声科完成，测量者事先未知每只大鼠的分组与用药情况，属于单盲操作。长径定义为冠状面上的最大高度H，横径为冠状面上的最大宽度W，矢状径为水平面上的最大厚度E。根据椭球公式可得出肾体积V的近似值，即：V=H×E×D×π/6，这种测量和计算方式被证明可以很好地评估肾脏体积[12，13]。

1.5 组织学

利用HE染色的切片计算囊肿体积密度(cyst volume density，CVD)，测量者事先未知每只大鼠的分组与用药情况，使用数点法[14]。为减少选择偏倚，从肾门处90°、180°、270°选取肾皮质，以防止区域选择偏差。

1.6 血生化

眼眶静脉取血(采用内眦取血法抽取大鼠静脉血)，促凝管收集后4 ℃下分离(3000 r/min，10 min)血清，冰浴下立即送我院检验科，测量BUN、Cr 2个指标。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况和CVD的比较

3组20只PCK大鼠实验过程中均无死亡，也无明显衰弱迹象。3组PCK大鼠摄食量和摄水量均无明显差异；体重均增加，但3组间无显著差异(P>0.05)。3组CVD无统计学差异(表1)。

2K/TBW：双肾质量/体重比；CVD：囊肿体积密度

2.2 超声下肾脏体积、肾脏内囊肿数、最大囊肿最大截面面积的比较

3组大鼠在4、8、12周龄3次超声测量中肾脏体积、肾脏内囊肿数、最大囊肿最大截面面积均进行性增加，且3组4、8周龄时超声结果无显著差异。12周龄时西罗莫司组肾脏体积比对照组减少17.5%(P<0.05)，肾脏内囊肿数比对照组减少26.3%(P<0.05)，最大囊肿最大截面面积比对照组减少39.7%(P<0.05)。环孢素组与对照组此3项比较无显著差异(P>0.05)，见表2。

2.3 血清BUN、Cr

3组大鼠血清4、6、8、10周龄BUN均无统计学差异。6周龄时环孢素组血清Cr比对照组增加11.7%(P<0.05)，其余时间无显著差异(表3)。

2.4 雌雄分别比较

为探讨2种药物在不同性别PCK大鼠中的影响，我们将西罗莫司组(n=6)、环孢素组(n=8)和对照组(n=6)中的雌雄鼠研究结果分开进一步探讨，分为西罗莫司M组(n=3)、西罗莫司F组(n=3)、环孢素M组(n=4)、环孢素F组(n=4)、对照M组(n=3)和对照F组(n=3)。雄性3个组大鼠双肾质量、2K/TBW、超声下肾脏体积、肾脏内囊肿数、最大囊最大截面面积，血清BUN、Cr和CVD等均无统计学差异(P>0.05)，在此不列表。

西罗莫司F组和环孢素F组大鼠双肾质量、2K/TBW均明显低于对照F组(P<0.05)，但西罗莫司F组与环孢素F组无统计学差异(P>0.05)；西罗莫司F组CVD明显低于环孢素F组和对照F组(P<0.05)，但对照F组与环孢素F组无统计学差异(P>0.05)，见表4。12周龄时西罗莫司F组和环孢素F组B超下肾脏体积明显低于对照F组(P<0.05)，但罗莫司F组与环孢素F组无统计学差异(P>0.05)，但雌性3组B超下囊肿数、最大囊肿最大截面面积无显著差异(P>0.05)，见表5。雌性3组血清BUN、Cr比较无统计学差异(P>0.05)，不在此列表。

3 讨论

西罗莫司通过阻断mTOR的过度活化可以减慢ADPKD疾病肾脏损害的进展，已有相关的动物实验[6，7]和分子水平的研究[15，16]证明。既往文献[17～21]表明FPC与ADPKD的责任蛋白质PC1、PC2有交互作用，AKT/mTOR信号通路在儿童ARPKD的肾脏组织中有活化[22]。目前，钙调磷酸酶(calcineurin, CaN)被认为对PC1和PC2都有作用[23]。对于PC2，目前认为PC1可以通过与其结合的CK2激酶磷酸化PC2，从而使钙通道开放，Ca2+内流，激活CaN，从而使PC2去磷酸化，CK2和CaN就形成相反的作用，达到一个平衡状态；对于PC1，目前认为PC1可以通过其他途径引起持续的Ca2+内流，而不是通过PC2，这个持续的Ca2+内流可以激活calcineurin/NFAT途径，CaN被激活后，将磷酸化的NFAT去磷酸化，使NFAT转移到细胞核中，与其相应的靶基因结合，转录并引起细胞增殖和分化。据此我们猜测mTOR阻滞剂如西罗莫司或CNI如CsA可能也会对ARPKD的疾病进程产生积极影响。

目前，在肾移植患者中，西罗莫司一般按2 mg/d的剂量给药，按500 g左右体重的大鼠体表面积校正后，用药剂量定为0.2 mg·kg-1·d-1较为合适， 大致与肾移植术后用量相同。在既往进行的类似实验研究中，Tao等[6]给实验给药的途径是腹腔注射，剂量是0.2 mg·kg-1·d-1，临床如果长期应用该给药方法很不方便。Wahl等[7]报道给药剂量为2 mg·kg-1·d-1，按体表面积计算，约是目前肾移植术后患者应用西罗莫司剂量的10倍，副作用及费用都显著增大，通过饮水给药会不会导致饮水量的变化，药物溶解在饮用水中2 d(该实验2 d更换1次饮水)是否有分解变质，对这些问题该实验均未能顾及。我们采用更符合临床用药特点的实验方案，即按0.2 mg·kg-1·d-1剂量灌胃(类似临床顿服药物)。肾移植患者CsA一般按3～5 mg·kg-1·d-1口服给药，同样按照体表面积校正后，用药剂量约为25 mg·kg-1·d-1，既往实验有这样的用法，但目的是为研究CsA的毒副作用[24]。Homan等[25]研究显示对于Lewis大鼠，CsA灌胃剂量在5 mg·kg-1·d-1或静脉注射剂量在2 mg·kg-1·d-1就可达到抗排异的作用而少有死亡，因此，我们采用最接近临床应用的5 mg·kg-1·d-1灌胃。

本研究结果显示从双肾质量、2K/TBW、CVD以及血清BUN等指标来讲，西罗莫司和CsA对PCK大鼠的疾病进程均无显著影响，与Renken等[5]的研究结果相似。本研究超声检查结果显示12周龄时西罗莫司组肾脏体积、肾脏内囊肿数和最大囊最大截面面积明显小于对照组(P<0.05)，但考虑到最终双肾质量及组织病理学检查均未体现出明显差异，我们认为有以下2种可能：①超声检查结果受到检查者主观判断的影响较大，存在不准确的可能；②囊肿本身形态不规则，在超声下计数、测量困难，易产生误差的可能。为减小这些误差，我们建议在今后的相关研究中采用CT、MRI或三维甚至四维彩超的检查手段。

本研究只在6周龄时环孢素组血清Cr值明显高于对照组(P<0.05)，其余时间3组血清BUN和Cr均无统计学差异(P>0.05)，这可能与实验进行的时间点大鼠周龄较小有关，Mason等[3]报道8周之前PCK大鼠无论雄性还是雌性，BUN和Cr方面均未表现出明显升高。

另外，由于既往类似研究中多仅采用雄性大鼠作为实验对象[6，7]，本研究雌雄大鼠各半，Mason等[3]报道雌性与雄性PCK大鼠的多囊肾发生和发展进程有差异，本研究结果显示虽然各组样本量偏少(n=3或4)，但结果仍显示出西罗莫司在雌性PCK大鼠身上能够减少囊肿数量、减小CVD，从而减小肾脏大小的作用。通过查阅既往文献，推测可能与雌激素的作用有关，Cowley 等[26]和Anderson等[27]的研究显示雌二醇用于雄性多囊肾大鼠可以下调AKT和mTOR的表达，从而限制肾皮质囊肿的增长和改善肾功能。我们猜测mTOR抑制剂可能与雌激素存在某种协同作用，从而减缓多囊肾疾病的进程，但需要进一步大样本量的实验及细胞或分子水平的研究。

本实验未能从细胞或分子层面对此问题做进一步的阐释，我们进一步的研究也将侧重于这方面。实验进行时间并不长，而我们知道多囊肾的发展过程相对漫长，我们只研究了ARPKD大鼠模型在疾病早期的变化特征和CsA、西罗莫司的药效情况，进一步的研究可以做一些更长时间的模型。

总体来讲，本研究结果否认西罗莫司和CsA对PKD大鼠疾病进程的影响,但西罗莫司对于雌性PKD大鼠的肾囊肿数量、大小的增长表现出一定的延缓作用，对肾功能无明显影响，有待后续研究。

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(修回日期：2017-01-31)

(责任编辑：李贺琼)

The Effects of Sirolimus and Cyclosporine on the Progression of Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease in PCK Rats

WangShuo,SongYimeng,HouXiaofei,etal.

DepartmentofUrology,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100083,China

HouXiaofei,E-mail:houxf12@163.com

Objective To observe the effects of sirolimus and cyclosporine in the progression of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) in an orthologous animal model of human ARPKD, the PCK rats. Methods Four-week-old PCK rats (n=20), sex in half, were randomly divided into control group (drug free drinking water,n=6), sirolimus group (n=6), and cyclosporine group (n=8), respectively. They were given daily gavage with drinking water, sirolimus dilution, or cyclosporine dilution. The body weight was measured every week. The renal function was monitored throughout the treatment periods at 4, 6, 8, and 10 weeks. The kidney volume, number of cysts and maximum area of the largest cyst under ultrasound were measured at 4, 8, and 12 weeks. The kidneys were harvested, weighed, and analyzed histologically (cyst volume density, CVD) at 12 weeks. ResultsNone of the PCK rats died during the study. The body weight was increased in all the rats, witnout significant difference among the 3 groups (P>0.05). At 12 weeks, the kidney volume (cm3), number of cysts and maximum area of the largest cyst (cm2) under ultrasound were reduced significantly in the sirolimus group than the control group [(1.65±0.25) cm3vs. (2.00±0.36) cm3,q=3.426,P<0.05; 31.75±6.57 vs. 43.08±10.28,q=3.638,P<0.05; (0.0828±0.0420) cm2vs. (0.1373±0.0536) cm2,q=3.966,P<0.05]. There were no significant differences between cyclosporine group and control group on kidney volume, number of cysts and maximum area of the largest cyst under ultrasound (P>0.05). The sirolimus group, cyclosporine group and control group showed no significant difference in kidney weight, 2-kidney/total body weight ratio (2K/TBW), serum BUN and Cr, and CVD at 10 weeks (P>0.05). Conclusion Sirolimus and cyclosporine showed no significant effects on the disease process of PKD rats.

Autosomal recessive polycystic kidney disease; PCK rat; Sirolimus; Cyclosporine; Estrogen

卫生部国际交流与合作中心项目(项目编号：IHECC08-201205)

A

1009-6604(2017)04-0348-06

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.04.017

2016-07-29)

**通讯作者，E-mail：houxf12@163.com

①病理科

②超声诊断科

③普通外科