HPLC-ELSD法检测烟草秸秆中水溶性糖

吴福芳，陈 悦，芦广银，马扩彦，戴 亚，盛良全*

（1.阜阳师范学院 化学与材料工程学院，安徽 阜阳 236037；2.重庆中烟工业有限责任公司 技术研发中心，四川 重庆400060）

HPLC-ELSD法检测烟草秸秆中水溶性糖

吴福芳1，陈 悦1，芦广银1，马扩彦2，戴 亚2，盛良全1*

（1.阜阳师范学院 化学与材料工程学院，安徽 阜阳 236037；2.重庆中烟工业有限责任公司 技术研发中心，四川 重庆400060）

建立一种采用45%乙腈水溶液作提取溶剂于40℃下超声萃取35 min，乙腈水溶液等度洗脱，ZORBAX Carbohydrate糖柱-HPLC-ELSD法测定烟草秸秆中水溶性糖含量的方法。水溶性糖的线性范围：鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的实验线性范围为8.0～1 000.0 mg/L，木糖、甘露糖的实验线性范围为16.0～1 000.0 mg/L，麦芽糖的实验线性范围为10.0～1 000.0 mg/L，且在此范围内相关系数均较好。相对标准偏差（RSD）（n=6）均小于3.73。结果表明此法准确简单、易操作、灵敏度高，适用于批量烟草秸秆以及烟草制品中水溶性糖含量的定量分析与测定。

糖分析柱；高效液相色谱法；烟草秸秆；水溶性糖

我国是烟草生产大国，每年产量约占全球的42%，烟草秸秆产量约为450万吨[1]。以往对烟草秸秆处理方式主要是焚烧和丢弃，有效利用率低。烟草秸秆作为一种重要的可再生生物质资源，它的合理开发利用有利于两烟产业可持续发展。对烟草秸秆组成成份分析等基础数据，是其科学、合理、有效、可持续发展的基础[2]。目前对烟草秸秆的成份报道不是很多，其中水溶性糖的研究较少[3]。而水溶性糖是烟草秸秆的重要组成成份，对烟草秸秆水溶性糖的合理分析关系到烟草秸秆的‘五化’利用[4]。因此，选择合适的方法及最佳测量条件，有利于烟草秸秆进一步应用研究。目前国内外农作物秸秆中的水溶性糖研究不是很多[5-9]，其对于烟草秸秆中水溶性糖的检测主要是按照烟草行业标准（YC/T 159—2002）进行测定，没有对烟草秸秆水溶性糖进行系统分析、检测。

高效液相色谱法是近些年来检测水溶性糖最多的方法之一，主要采用的是示差折光检测器[10-11]和蒸发光散射检测器[12-15]。相对于示差折光检测器，蒸发光散射检测器的灵敏度要高，适用范围较广。且比传统的化学方法精确度高（能检测单一糖的成分），耗时短，成本低。本文采用安捷伦糖分析柱为固定相、乙腈-水作流动相、蒸发光散射检测器，实现了烟草秸秆中7种水溶性单糖和二糖的同时测定。为生物质秸秆中水溶性糖的快速分析奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

实验所用烟草秸秆来自阜阳当地收割。YL9100高效液相色谱系统、YL9181蒸发光散射检测器(ELSD)（托摩根生物科技有限公司）；微量进样器（0.1mL）；分析天平（0.000 1 g）（上海越平科学仪器有限公司）；0.22μm水系微孔滤膜、0.22μm有机系微孔滤膜，SPE-C18固相萃取小柱（BOJIN），全自动固相萃取仪（SPE-8上海本昂科学仪器有限公司）；DZX-1型（6050B）真空干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）、YB-500A型高速多功能粉碎机（永康市速锋工贸有限公司）、SHB-ⅢS循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；UP型超声纯水机（优普仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

准确称取已烘至恒重的烟草秸秆粉末0.5 g，精确至0.000 1 g，置于25mL容量瓶中，加入10mL 45%（体积分数）乙腈水溶液，于40℃下超声波辅助提取35 min，抽滤，滤液用45%乙腈水溶液定容至25mL。样液用预活化好的SPE-C18固相萃取小柱[16-18]（活化方法：先用15mL甲醇活化，再用30mL超纯水平衡）处理后，再经0.22μm有机过滤膜过滤，置于离心管中，待进样分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX Carbohydrate（4.6mm×250mm，5μm）（南昌捷岛科学仪器有限公司）；流动相：乙腈/水（V/V）=75∶25，流速为1.0mL/min，恒温器温度：25℃；ELSD Spray Chamber温度：30℃，Drift Tube温度：60℃；载气：高纯氮（≥99.999%），压力：0.5 MPa；进样量：20μL。

1.2.3 标准溶液配制

准确称取已经烘干的鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖各0.1 g，甘露糖0.2 g，精确至0.000 1 g，均置于100mL小烧杯中，加适量45%乙腈水溶液，搅拌加速溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得糖标准储备液，置于4℃冰箱中保存。实验中所用工作液浓度为储备液的0.5倍。准确移取5mL糖标准储备液于10mL容量瓶中，用45%乙腈水溶液定容至刻度，摇匀即得到标准工作液。

2. 结果与讨论

2.1 色谱条件

2.1.1 流动相的选择

用乙腈和水作为高效液相色谱分析的流动相，在固定流速为1.0mL/min，恒温器温度为25℃，ELSD Spray Chamber温度为30℃，Drift Tube温度为60℃，N2压力维持在0.5 MPa，分别在乙腈-水溶液体积比为70∶30、75∶25、80∶20时，进样20μL分析各组分糖的分离情况。数据处理结果见表1。

根据数据分析发现：乙腈在流动相中比例增大，有利于各组分峰的基线分离，但是乙腈比例增大也会导致分析时间延长。在乙腈体积比为70%时，木糖与果糖，甘露糖与葡萄糖未分开，其它糖已达到完全分离；在乙腈体积比为75%时，只有木糖与果糖分离度R＜1.5，其余各峰间分离度值R≥1.5，即各糖分峰基本分离；在乙腈体积比为80%时，各峰间分离度值R＞1.5，各组分糖完全分离，但分析时间较长，但各糖分的峰展宽较严重，尤其是蔗糖和麦芽糖的峰较宽。综合考虑分析时间、分离效果、峰展宽情况等因素，此次分析选择乙腈∶水=75∶25的体系作为流动相。

流速对分离效果也具有一定的影响，流速增大可以缩短保留时间，但流速过大分离不完全，而流速过小又会导致分析时间长且峰形变宽。在乙腈∶水=75∶25条件下，进一步分析不同流速（0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min）对分离效果的影响，对谱图进行分析后得数据表2。流速为1.0和1.2mL/min时，各峰间的分离度R≥1.3，各组分基本分离，且半峰宽也相差不大，在1.2mL/min时压力较大，故选择流速为1.0mL/min。

表1 不同流动相下各组分糖的分离度

表2 不同流动速度下各组分糖的分离度

2.1.2 ELSD参数设定

载气流速，漂移管温度与恒温器温度是ELSD调节的主要参数。载气的流量决定雾化时液滴形成的大小。气体流量越高形成的液滴越小，容易蒸发，散射光的强度较弱，产生的信号较小。但若载气流速过小，流动相不能完全蒸发，背景噪音大。漂移管温度的高低也同样存在信噪比和背景噪音的问题。本实验在N2压力维持在0.5 MPa，漂移管温度在60℃下，色谱图分离情况较佳。

在确定的流动相和流速下，ELSD Spray Chamber温度为30℃，Drift Tube温度为60℃，N2压力维持在0.5 MPa，进样量为20μL，恒温器温度分别设置为20℃、25℃、30℃，进行进样分析，结果显示，恒温器温度对保留时间、峰形的影响都不大，在实验中不同柱温时，各糖分已达基本分离。25℃与室温较接近，温差小。故选择了25℃作为ELSD工作温度。条件优化后，7个糖组份都得到较好的分离，如图1。

2.2 样品处理条件的优化

2.2.1 萃取剂比例的选择

依据文献[15]，选用乙腈水溶液作为萃取剂，分别用0、35、40、45、50、55、60%乙腈水溶液10mL，平行做2组。相对于纯水，乙腈水溶液提取时甘露糖、蔗糖和麦芽糖影响不大，但其它糖分提取效果较好。萃取剂乙腈比例在45%时，鼠李糖提取量略低于乙腈比例为40%的，但是其它各组分糖提取量较其他条件下比较好，故选择45%乙腈水溶液作为萃取剂。实验数据处理结果见表3，表中为平行实验萃取平均值。

2.2.2 萃取剂体积的选择

分别考察了萃取剂为4、6、8、10、12、14mL时萃取的结果见表4。分析数据结果可知，萃取剂体积在10mL时，样品中糖分提取相对较完全。

图1 7种水溶性糖混合标准溶液的HPLC-ELSD色谱图

表3 乙腈与水不同浓度比例与水溶性糖的萃取关系

表4 不同萃取剂体积与水溶性糖的萃取关系

2.2.3 萃取时间的选择

于40℃下超声波辅助提取不同时间，分别为10、20、30、40、50、60 min，平行做2组。实验结果见表5，超声萃取大概35 min时，样品中糖提取量最高。随超声时间的延长，各组分糖提取量基本不变。故选择超声辅助提取35 min。

表5 不同萃取时间与水溶性糖的萃取关系

2.2.4 萃取温度的选择

在上述选定的条件下，于30、35、40、45、50、55、60℃下超声波辅助提取，实验数据处理结果见表6，温度升高有利于糖分溶出。随着温度的升高，糖分提取量也增加，但是温度超过40℃时，总糖量呈现下降趋势。所以样品处理温度选择为40℃。

2.3 方法评价和应用

2.3.1 线性范围与检出限

量取配制的糖标准储备液0.08、0.10、0.25、 0.50、1.00、2.00、5.00、8.00、10.00mL，分别置于10mL容量瓶中，用45%乙腈水溶液定容，得系列浓度的糖标准溶液。在优化的色谱条件下进行HPLC分析，浓度由低到高依次进样。并以各糖的峰面积（mV·S）的对数为纵坐标，以标准溶液的浓度（mg/L）的对数为横坐标进行线性回归，即可得到线性回归方程。同时，处理烟草秸秆样品20份，0.01 g/份，进行二十组空白实验，以3倍的标准偏差计算检出限。表7为7种水溶性糖的双对数标准曲线。

表6 不同萃取温度与水溶性糖的萃取关系

表7 7种水溶性糖类化合物的双对数线性方程

水溶性糖的线性范围：鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的实验线性范围为8.0～1 000.0 mg/L，木糖、甘露糖的实验线性范围为16.0～1 000.0 mg/L，麦芽糖的实验线性范围为10.0～1 000.0 mg/L，且在此范围内相关系数均较好。

2.3.2 精密度

准确称取6份已烘至恒重的烟草秸秆样品，0.500 0 g/份。预处理后在选定的色谱条件下进行HPLC分析，根据6次重复测定，记录各组分糖的峰面积，计算相对标准偏差（RSD）。烟草秸秆中水溶性糖的精密度实验数据处理结果见表8。除鼠李糖外，其余各糖分RSD＜3.73，表明该方法的精密度良好。

表8 烟草秸秆中水溶性糖的精密度实验（n=6）

2.3.3 回收率和稳定性

准确称取3份已烘至恒重的烟草秸秆样品，0.500 0 g/份。样品1不加混合母液，其他2份分别加入不同等级浓度的混合母液，进行回收率实验。平行做6组，计算相对标准偏差（RSD）。对样品1在0、40、60、100、140、260 min后，进样测定分析。计算于室温下放置不同时间后糖分的浓度，判断样液的稳定性。

烟草秸秆中水溶性糖的回收率实验数据及处理结果见表9，各糖回收率为70.5%～141.2%。烟草秸秆中水溶性糖的稳定性实验数据处理结果见表10。根据实验结果发现1 h内，样液中水溶性糖浓度变化不大，所以最好在样液提取后1 h内进样检测分析。

表9 烟草秸秆中水溶性糖的回收率实验（n=6）

表10 烟草秸秆中水溶性糖的稳定性实验

3 结论

本实验采用45%乙腈水溶液于40℃下超声波辅助提取35 min，经过抽滤、定容，再用预活化好的SPE-C18固相萃取小柱处理，最后经0.22μm过滤膜过滤，ZORBAX Carbohydrate糖柱-高效液相色谱-蒸发光散射检测，建立一种烟草秸秆中水溶性糖含量测定的方法。在不同添加水平下，回收率为70.5%～141.2%，精密度（RSD）为0.77%～3.73%（n=6）。该方法准确简单、易操作、灵敏度高、线性范围宽，适用于批量烟草秸秆以及烟草制品中水溶性糖含量的常规检测。

[1]叶协锋，刘红恩，孟 琦，等．不同类型烟秸秆化学组分分析[J].烟草科技，2013（10）：76-79.

[2]谢庚楠.基于NIRS的水稻和油菜秸秆干物质和可溶性糖快速测定方法及模型建立[D].武汉：华中农业大学，2013.

[3]赵德清，戴 亚，冯广林，等.烟秆的化学成分、纤维形态与生物结构[J].烟草科技，2016，49（4）：80-86.

[4]牛文娟，肖卫华，刘 贤，等.秸秆可溶性糖测定时样品前处理条件的优化[J].中国农业大学学报，2012，17（5）：99-104.

[5]胡文冉，范 玲，马 盾，等.棉纤维糖分不同提取方法的比较[J].新疆农业科学，2010，47（2）：308-311.

[6]余汝华，赵丽华，莫 放，等.玉米秸秆青贮饲料中水溶性碳水化合物测定方法研究[J].饲料工业，2003，24（9）：38-39.

[7]付苗苗，刘梅英，牛智有，等.基于近红外光谱法的水稻秸秆可溶性糖快速检测[J].华中农业大学学报，2016，35（2）：115-121.

[8]Godin B,Lamaudiere S,Agneessens R A,et al.Chemi-cal characteristics and biofuel potential of several vegetal biomasses grown under a wide range of environmental conditions[J].Industrial Crops and Products, 2013,48(48)：1-12.

[9]Pordesimo L O,Hames B R,Sokhansanj S,et al.Variation in corn stover composition and energy content with crop maturity[J].Biomass&Bioenergy,2005,28 (4)：366-374.

[10]Sánchez-Mata M C.Cámara-Hurtado M,Díez-Marqués C.identification and quantification of soluble sugars in green beans by HPLC[J].European Food Research and Technology,2002,214(3)：254-258.

[11]王 岚，李 忠，蒋次清，等.HPLC法同时测定烟草和料液中的糖和保润剂[J].烟草科技，2006（8）：25-28.

[12]周元清，吴兆录，史云东，等.高效液相色谱法测定烟草料液中的糖[J].分析试验室，2006，25（9）：71-74.

[13]孙雨安，王国庆，张应军，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定烟草中水溶性糖[J].分析科学学报，2004，20（5）：531-533.

[14]杨 俊，刘江生，蔡继宝，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定烟草中的水溶性糖[J].分析化学，2005，33（11）：1596-1598.

[15]胡 斌，王 昇，谢复炜，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测法在烟用香精料液中水溶性糖及山梨醇分析中的应用[J].色谱，2012，30（3）：298-303.

[16]程 勇，李庆廷，李剑政，等.Prevail糖柱-HPLCELSD法测定烟草中水溶性糖[J].烟草科技，2010（3）：32-37.

[17]毛智慧，汤建国，杨 继，等.烟草中水溶性糖的超高效液相色谱分析及聚类分析研究[J].分析试验室，2011，30（3）：115-118.

[18]汤建国，袁大林，乔丹娜，等.超高效液相色谱法测定烟草料液中7种水溶性糖[J].香料香精化妆品，2012，8（4）：13-16.

Determination of water-soluble sugar in tobacco straw by HPLC-ELSD

WU Fu-fang1，CHEN Yue1，LU Guang-yin1，MAKuo-yan2，DAI Ya2，SHENG Liang-quan1*
(1.School of Chemistry and Materials Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;2.Technology R&D Center,China Tobacco Chongqing Industrial Co.,Chongqing Sichuan400060,China)

A method for determination of water-soluble sugar in tobacco straw was developed.The water-soluble sugar was extracted by using 45%acetonitrile water solution under ultrasonic,and was analyzed by HPLC-ELSD using ZORBAX Carbohydrate sugar column.The linear range of rhamnose,fructose,glucose and sucrose was 8.0～1 000.0 mg/L;the linear range of xylose and mannose was 16.0～1 000.0 mg/L;and the linear range of maltose was 10.0～1 000.0 mg/L,and the correlation coefficient is better in this range.Relative standard deviation(RSD)(n=6)was all less than 3.73.The method for determination of water-soluble sugar in tobacco straw is simple,easy to operate,accurate,sensitive and suitable for quantitative analysis and determination of water-soluble sugar in tobacco and tobacco products.

sugar analysis column;high performance liquid chromatography;tobacco straw;water-soluble sugar

TS49

：A

：1004-4329（2016）04-037-07

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2016)04-037-07

2016-09-22

安徽省高等学校自然科学研究项目（KJ2016A548）；安徽省省级学科建设重大项目（皖教秘科[2014]28号）；卷烟减害降焦四川省重点实验室开放课题（hx2015005）资助。

吴福芳（1985- ），女，博士，讲师，研究方向：药物合成。

盛良全(1965- ），男，博士，教授，研究方向：生物无机及分析化学。Email：shenglq@fync.edu.cn。