Ⅱ型神经纤维瘤病的分子遗传学研究进展

高旦华 蔡汉炯 蒋红芳 何梦甜 夏菁 冯晓燕

Ⅱ型神经纤维瘤病的分子遗传学研究进展

高旦华 蔡汉炯 蒋红芳 何梦甜 夏菁 冯晓燕

Ⅱ型神经纤维瘤病（NF2）为NF2相关的常染色体显性遗传病，发病率约为1：210000，临床表现多样，早期诊断困难，治疗复杂，预后效果差[1]。所以，在深入阐明其病理生理的基础上，需要对其分子机制进一步研究，开展基因诊断和基因治疗也将成为未来的研究热点。1993年，Rouleau、Troffater同时克隆出了抑癌基因NF2，该基因编码的蛋白质Merlin主要分布于神经系统和视网膜细胞的膜褶皱、细胞突触和轴突上，通过调节细胞之间的接触和细胞内信号传导来调节细胞的生长速度和运动能力，主要表现为抑制细胞异常增殖，增加有丝分裂中G0/G1期比例，诱导细胞凋亡。自NF2基因被发现，关于Merlin的研究已经有了重要突破，但是关于其作用机制尚不明确[2]。本文在简单介绍NF2的临床症状及遗传特点的基础上，主要围绕Merlin展开，对Ⅱ型神经纤维瘤病的分子致病机制及最新研究进展进行总结，以期为临床上的诊断提供启示。

1 Ⅱ型神经纤维瘤病的临床症状

Ⅱ型神经纤维瘤病属于神经皮肤综合症疾病之一，主要累及中枢神经系统，以双侧听神经瘤为显著临床特征[3]，常伴颅内和脊髓的脑膜瘤、室管膜瘤、神经胶质瘤、迟发性晶状体混浊、神经末梢纤维瘤以及皮肤的神经鞘膜瘤等[4]。该疾病患者通常在20～40岁之间出现临床症状，而18%的患者以前已经发病，最终发展至NF2的患者约90%表现为双侧听神经瘤，一些成人NF2患者合并有单侧感音神经性耳聋（SNHL），更甚者是对称或非对称的双侧SNHL，呈现渐进性听力下降，偶尔会发生突发性SNHL，可伴随耳鸣、平衡失调和头疼[5]。假如颅神经上有神经鞘瘤，或者颅神经被巨大的听神经瘤压迫，最终会出现面部麻木、无力、吞咽困难及声音嘶哑等症状。一般在听力下降之前，患者身上已经存在皮肤和脊髓肿瘤，该症状在年龄＜15岁的患者中较为常见，在所有NF2患者中占70%～85%；80%～90%的NF2患者会发生无症状的脊髓肿瘤，25%～30%的患者会出现临床表现，比如压迫脊髓症。

2 Ⅱ型神经纤维瘤病的遗传突变与表型

Ⅱ型神经纤维瘤病是由抑癌基因NF2突变导致的、常染色体显性遗传的多肿瘤综合征[5]。约50%的NF2病理表现为家族遗传病史，另外50%的病例未发现明确的家族史，这类患者可能是非遗传因素导致的新的基因突变。该基因位于22号染色体一区二带（22q12），含有17个外显子。

NF2基因符合Knudson的肿瘤“两次打击学说”（two-hit theory），即肿瘤只有在NF2基因的两个等位基因都失活的情况下才会发生[4]。NF2的基因突变率约为6.5×10-6，迄今已确定＞200多种的NF2基因突变，包含插入和小基因缺失引起的阅读框移位，点突变导致新终止密码的形成，点突变改变的交接点，从而导致基因产物的异常；另外剪切位点突变也十分常见，比如外显子跳跃、异常的成熟前终止密码子[5]。查询人类基因突变数据库，发现Ⅱ型神经纤维瘤病的致病突变包括：27.1%的无义突变和错义突变，26%的小片段缺失，24.5%的剪切突变，12.5%为大片段缺失，6.3%的小片段缺失，剩下的是一些罕见突变，如大片段的缺失[6]。

神经纤维瘤病Ⅱ型的病死率主要由基因型和表型决定，其中错义突变引起的病死率比无义突变和移码突变低，可能的原因是无义突变或移码突变会导致蛋白质截短，导致严重的临床表现[7]。但是，错义突变和大片段的缺失使得蛋白产物不能形成，只会形成轻微的临床表现。另外，疾病的严重程度还与剪接处的突变有关，突变位于第1～5个外显子比位于第11～15个外显子更为严重。

3 Merlin的结构与功能

Merlin是NF2基因编码的抑癌蛋白，包含595个氨基酸，在脊椎动物中分子大小为70kDa，与红细胞膜蛋白4.1超家族中的埃兹蛋白（Ezrin）、根蛋白（Radixin）和膜突蛋白（Moesin）非常相似。已知在人类中存在10中亚型，主要为Ⅰ型和Ⅱ型：亚型Ⅰ含595个氨基酸残基，由外显子1～15和17拼接成；亚型Ⅱ含590个氨基酸，由外显子1～15和16拼接而成[8]。该蛋白由3个部分组成：N端的FERM结构域、中间的α螺旋和极性亲水的C端[9]。只有在首尾自我联合时才能抑制肿瘤的活性，而在两种亚型中，只有亚型Ⅰ能够形成首尾结构[10]。

在功能方面，Merlin是一个细胞膜-细胞质骨架蛋白，位于细胞膜和细胞骨架接口处，能够调控细胞外信号介导的细胞迁移、细胞骨架重塑和细胞增殖[11]。研究表明，Merlin蛋白在调控细胞迁移和维持细胞正常形态上发挥着重要的作用，其功能的异常和缺失会影响体内的某些促有丝分裂途径、细胞骨架的形成和细胞粘附作用的大幅改变，最终导致肿瘤的发生[12]。

4 Merlin的相关蛋白

Merlin蛋白可以和许多跨膜或细胞内蛋白相互作用，包括TRBP（一种反式作用因子）、eIF3c、PIKE、CD44、CD43、HA受体、FAT（钙粘结蛋白）、整联蛋白β1、layilin、DCC、NHE-RF/EBP50、桩蛋白、肌球蛋白、βⅡ膜收缩蛋白、微管蛋白、SCHIP蛋白、calpain蛋白、HRS（一种肝细胞生长因子）、NGB、Grb2、RhoGDI和CRM1/B输出蛋白等[13]，是这些蛋白之间的锚定分子。下面详细介绍几个重要的相关蛋白。

TRBP是干扰素诱导的双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）的调节蛋白，具有癌蛋白活性，能够与核糖体发生相互作用，该蛋白的过量表达会导致细胞的增殖加快[14]。Merlin与TRBP发生相互作用的区域是C末端残基的288-595位，TRBP的过度表达使得细胞过度增殖，而Merlin能够抑制TRBP的功能，从而抑制肿瘤的形成[15]。

eIF3c是真核转录起始因子，是启动蛋白质翻译所必须的。有研究指出，在脑膜瘤细胞中，Merlin和eIF3c的表达呈反向关系：Merlin通过与eIF3c结合，抑制其介导的蛋白质翻译过程[16]。另外，Lee等证明：当细胞周期蛋白D1的表达过度时，Merlin对细胞增殖的抑制作用会减弱[17]。因为细胞周期蛋白D1是一种翻译控制蛋白，所以推测Merlin抑制信号的传递最终会作用于eIF3c，进而控制蛋白质翻译的程度。

PIKE（phosphoinositide 3kinase enhancer）是一种能增强磷酸肌醇3激酶（PI3激酶）活性的GTP酶。之前有研究表明，PIKE可以与Merlin的N端发生相互作用，细胞中Merlin含量的增加能够降低磷酸肌醇激酶的含量，抑制PI3激酶信号肽的活性，控制细胞增殖速度[18]。

5 Merlin的相关机制

5.1 Merlin的磷酸化 Merlin与ERM蛋白具有序列同源性，有3个结构域：N末端的FERM结构域、中间的α螺旋结构域、C末端的FERM结构域[11]。通过FERM结构域Merlin蛋白可以结合大量的膜蛋白[19]。Akt导致Merlin在230位苏氨酸残基（T230）与315位丝氨酸残基（S315-Merlin）上发生磷酸化[20]；PKA介导第10位苏氨酸发生磷酸化（T10-Merlin），从而影响细胞骨架actin[21]；PKA和PAK1/2使得Merlin在第518位苏氨酸（S518-Merlin）处发生磷酸化，并且不使蛋白发生降解[20]，但是该处的磷酸化使得Merlin的肿瘤抑制功能消失了[22]。

磷酸化是Merlin构像和肿瘤抑制活性的一个关键调节点，磷酸化的发生阻碍了Merlin蛋白C端和N端的相互作用，导致其首尾结构由有活性的“关闭”状态转变为无活性的“开放”状态，失去了对肿瘤的抑制作用[10]。Paola AG等[23]发现Merlin的在不同部位的磷酸化产生的影响并不相同：T230和S315会引发自身蛋白的降解，S518会使其丧失肿瘤抑制功能。

Merlin也可以通过与PAK1的PBD结构域结合反馈性的抑制PAK1的活性[24]。肌球蛋白可以磷酸化MYPT1-PP1，同时低磷酸化Merlin使其活化。在神经鞘瘤和脑膜瘤细胞中，Merlin蛋白还受到一种钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶calpain的调控，其活化可以使蛋白Merlin裂解失活[11]。还有一些研究结果表明，大部分NF2家族性肿瘤综合征患者都有N末端的FERM结构域缺失[19]。

5.2 Hippo信号通路 Hippo信号通路，又名Salvador/Warts/Hippo（SWH）信号通路，通过调节细胞增殖与促进凋亡对器官大小和组织再生进行控制，与肿瘤的发生发展有着直接的关系[25]。研究发现，该信号通路在进化过程中高度保守，在果蝇和哺乳动物中该信号通路上的许多相关蛋白高度同源。最近在果蝇中发现，Merlin蛋白定位于Hoppi信号通路的上游区域，对该通路起着调控作用[26]。相关研究表明，Merlin蛋白和Expanded蛋白调控Hippo通路的功能部分重叠，它们的突变可以增加细胞的分裂，减少凋亡[26]。无论在果蝇属还是哺乳动物中，Merlin蛋白都能激活Hippo通路，抑制肿瘤的形成。

5.3 PI3K/Akt/mTOR信号通路 PI3K/Akt/mTOR信号通路是细胞内一个重要的调节细胞周期的信号通路，其与细胞分裂周期、增殖、癌症和寿命直接相关。PI3K位于细胞膜上，能够激活磷酸化和AKT[27]。AKT能够激活CREB[28]、抑制p27[29]、使FOXO定位于细胞质内[29]、激活PtdIns-3ps[30]、激活会影响p70或4EBP1转录水平的mTOR[29]。之前的研究表明，许多因子，比如EGF[31]、shh[28]、IGF-1[28]、insulin[29]和CaM[30]，都会增强PI3K/AKT信号通路，而PTEN[32]、GSK3B[28]和HB9[31]会抑制该信号通路。

在许多肿瘤细胞中，该信号通路过度活跃，导致细胞凋亡减少、细胞过度增殖。已经有研究证明，正常的Merlin蛋白直接结合于PIKE-L（磷酸激酶3激酶增强子）上，抑制其对PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）的激活作用，使得PI3K/Akt的信号传导被减弱，同时Akt可以反馈磷酸化的Merlin蛋白，促进Merlin发生泛素化而降解。另一方面，Akt的磷酸化作用增强了Merlin和磷酸肌醇类的亲和性，使得Merlin预凋亡作用被抑制。而且，Akt的磷酸化作用和表皮生长因子都会导致Merlin在细胞膜边缘的聚集，促进细胞的迁移[33]。5.4 MAPK/ERK信号通路 MAPK/ERK信号通路，又名Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，主要是将细胞表面受体上的信号传递至细胞核中的DNA，由一系列的蛋白质组成，比如MAPK（丝裂原激活蛋白激酶，最初命名为胞外信号调节激酶，及ERK），蛋白质之间的相互作用通过给相邻蛋白增添一个磷酸集团，磷酸化和去磷酸化代表蛋白的“开关”[34]。当信号通路中的某一蛋白质发生突变时，该蛋白即处于激活或失活状态，这是许多癌症发展的由来。Ammoun等[35]研究表明，ERK活性和Merlin的调节作用紧密相关，在Merlin缺失的神经鞘瘤中ERK的活性严重失调，所以当Merlin的表达失调时，细胞表面的信号不能传导至细胞核，细胞与细胞之间的信息传递紊乱，引起细胞的异常增殖，接触抑制现象减弱。

6 结语

现阶段，Ⅱ型神经纤维瘤病诊断水平还停留在临床、影像学及病理学诊断，为了提高诊断效率，基因诊断将成为必然趋势。Merlin作为一个能和多种蛋白质和信号肽发生相互作用的抑癌蛋白，其功能异常或缺失会影响体内细胞的增殖，导致癌症的发生。然而，人们尚不清楚哪条信号通路是Merlin影响神经纤维瘤病Ⅱ型发生的关键。不过，随着科研水平的不断提高，科研人员将不断加强NF2的分子生物学研究，深入了解该疾病的分子致病机制，一方面可以针对相应机制中的蛋白开发新药，如PDK1抑制剂、Merlin代替物等，改善神经纤维瘤病Ⅱ型患者的治疗效果；另一方面能够对家族性病例提供指导，比如产前诊断、计划生育咨询等，以及在基因水平进行检测，比如分子标记物S518-Merlin。

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