Ras相似物GTP酶与肿瘤

陈宝东 徐如祥

Ras相似物GTP酶与肿瘤

陈宝东 徐如祥

细胞迁移参与组织形成、胚胎发育、炎症反应、伤口愈合、动脉粥样硬化等多种生理、病理过程，且贯穿于肿瘤转移的全过程。细胞迁移需要胞外、胞内信号分子调控细胞骨架动力装置所给予的驱动力，与肌动蛋白细胞骨架介导的粘附所提供的锚定力之间的协调运作。小分子Ras相似物（Rho）蛋白是改变细胞骨架组装，调控细胞迁移进而参与肿瘤转移的关键因子。Rho GTPase在调节肿瘤细胞功能方面起了关键作用，包括细胞的恶性转化和迁移。其家族成员在调节细胞肌动蛋白的重组、细胞移动、细胞间及细胞与胞外基质的黏附、细胞周期、基因表达和凋亡过程中也发挥重要作用，其中每个功能对癌症的发生和进展都极为重要。Rho GTPase也能增加细胞对DNA损伤的易感性，包括抗肿瘤药物和电离辐射，对Rho GTPase的调节可以影响传统抗肿瘤治疗的效果和/或副作用，以Rho GTPase为靶点，选择高效特异的Rho GTPase抑制剂会明显增加抗肿瘤治疗的效果。

Ras相似物GTP酶；侵袭转移；靶向治疗

Ras相似物（Ras homologue，Rho）属于小分子G蛋白超家族，主要包括Rho、Rac和Cdc42三个亚家族，现有23个成员。Rho家族与Ras约有30%的同源氨基酸序列，是重要的细胞内信号转导分子[1-5]。目前研究发现，Rho家族成员对于调节细胞骨架、细胞运动、粘附、增殖、凋亡、转化，细胞周期进展，以及恶性肿瘤细胞的浸润和转移具有重要作用。研究发现，Rho家族成员在乳腺癌、胰腺癌、大肠癌、头颈部肿瘤中高表达，并且与这些肿瘤的侵袭、转移密切相关，提示Rho家族成员可能成为新的肿瘤标志物，对于判断肿瘤的恶性程度具有重要意义，有望用于肿瘤的基因治疗。

Rho GTPases作为分子开关，在活性型/GTP与非活性型/ GDP构象间循环。主要有3种蛋白调控GTPase循环：鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）、GTPase激活蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）和鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子（guanine nucleotide dissociation inhibitors，GDIs）。活性型/GTP与非活性型/GDP开关作用由GEFs的反作用调节，通过GDP向GTP转换，促进了活性型/GTP的形成；GAPs激活内源性GTP水解酶活性，使GTP水解，Rho GTPases失活。另外，GDIs也调节Rho蛋白，并抑制了GEF的催化作用，阻抑GDP从GTPases上分离，维持GTPase在一个非活性状态[6-9]。

小G蛋白作为一种分子开关，在细胞信号传导中起着举足轻重的作用，能被多种细胞外信号所激活。研究发现改变Rho蛋白某些功能区的结构可使其处于持续激活状态或失活状态，导致其功能增强或丧失。小G蛋白功能还依赖于异戊二烯化，异戊二烯化是指被15个碳的法尼基或者20个碳的香叶香叶基酯化修饰，修饰的位点是C端的半胱氨酸，被修饰的蛋白含有C末端的CAAX盒子结构。异戊二烯化由两种酶催化，即法尼基转移酶和香叶基转移酶。酯化修饰的意义在于给小G蛋白按上了能与膜结合的分子挂钩，从而提供了与上游和下游调节蛋白作用的最佳膜结合位置[10,11]。

目前，大量的Rho蛋白效应物已经被成功鉴别，绝大多数Rho蛋白的效应物都具有激酶活性和一个分子内自抑制区域。当效应物未同Rho蛋白结合时，自抑制区域同激酶活性区域结合，抑制了效应物的激酶活性。Rho蛋白同GTP结合后，即可进一步同效应物的自抑制区域结合，使其同激酶活性域解离，从而使效应物激活，有时这个过程还需要其他的蛋白参与。Rho蛋白在哺乳动物体内的效应物包括：Rho连接激酶（Rho associated coiled-coil kinase，ROCK）；Wiskott Aldfich综合症蛋白（Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP）；p21激活激酶（p21-activated kinase，PAKs）、MLK-3及PI3等[12]。

一、Rho GTPases的上游信号途径

溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）刺激成纤维细胞，诱导局部粘连及肌动蛋白应力纤维形成。Rac调节的信号途径与生长因子受体和质膜肌动蛋白聚合作用有关。生长因子如血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素和蛙皮素刺激肌动蛋白在质膜聚合，产生层形足板和膜皱褶，此过程能被Rac的显性负相突变体RacN17所抑制。缓激肽使Cdc42活化后，促进外周肌动蛋白微端丝和丝足形成，随后形成层形足板，此过程能被Cdc42的显性负相突变体Cdc42N17所抑制。磷酸肌醇-3激酶（phosphor-inositide 3 kinase，PI3K）与PDGF和胰岛素诱导产生层形足板和膜皱褶有关。通过PI3K途径，PDGF刺激GEF活性增强，使GTP-Rac增加[13]。而且，用PI3K抑制子wortmannin处理成纤维细胞后，能抑制Rho和Rac调节的膜皱褶，此膜皱褶由PDGF、表皮生长因子（EGF）和胰岛素或胰岛素样生长因子（IGF-1）诱导产生。提示PI3K作为Rac的上游因子，当有细胞外生长因子刺激时，诱导产生膜皱褶[13-15]。

Rho的另一个上游信号途径是交换因子Vav的酪氨酸磷酸化，可激活Rho家族成员。如前所述，Vav是Rho，Rac和Cde42家族的GEFs。当暴露于Src家族成员淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，Lck）下时，Vav增加GDP／GTP的交换活性。Vav与Lck共表达增加了Vav转化活性和诱导c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）活性的能力。总之，细胞外刺激如LPA，PDGF，EGF和胰岛素，启动了PI3K途径使Rho GTPases介导的肌动蛋白细胞骨架组装和形成。并且酪氨酸磷酸化也与Rho GTPases的激活有关[16-18]。

1.Rho GTPases的下游信号通路

Rho激活下游ROCK。Rho／ROCK信号通路增加肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）磷酸化和丝切蛋白（cofilin）磷酸化，致肌动蛋白应力纤维形成。相反，Rac／PAK通路减少MLC磷酸化但增加cofilin磷酸化，促使层形足板形成。此外，Rho/ROCK和Rac/PAK通路均增加Lin-ls1.MLC三种同源异型蛋白激酶、cofilin磷酸化，促进肌动蛋白聚合。Cdc42结合WASP，影响肌动蛋白和微管结构。

2.PAKs

PAKs是一类分子质量为60 000～70 000保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是Rho GTPase的下游效应分子，它可以被活化的Cdc42／Rac1激活。目前已发现两个亚群，第一个亚群包括PAK1、PAK2和PAK3，第二亚群包括PAK4、PAK5和PAK6。第一个亚群PAK在N-端含有Scr同源序列3（SH3）-结合基序和P21蛋白结合域（P21 binding domain,PBD），C-端激酶域为高度保守的序列，可通过结合Cdc42或Rac发挥生物活性。第二亚群PAK的生物学机制仍不清楚。PAK家族成员在细胞迁移过程中细胞骨架重组时起重要作用。研究发现，PAK直接活化跨膜鸟苷酸环化酶（GCs）导致细胞cGMP水平升高。此外，也证实Rac/PAK/GC/cGMP水平调节生理学反应的一个新的机制[19-22]。

3.ROCK

Rho连接激酶是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，包括P164ROKα（ROCK2）和P160ROKβ（ROCK1）2种亚型。ROCK由N端的激酶区，居中的螺旋区，C端的PH区和半胱氨酸富含区组成。ROCK接受Rho传递的活化信号，致使多个氨基酸位点磷酸化而被激活，并介导下游一系列磷酸化-脱磷酸化反应[23]。ROCK抑制酶活性使得MLC的丝氨酸残基磷酸化，从而增加肌动-肌球蛋白GTP酶的活性，促进肌动、肌球蛋白的收缩。ROCK活化LIMK，磷酸化cofilin，该蛋白是一种肌动结合蛋白，ROCK还可能磷酸化内收素使其定位于运动细胞的边缘。ROCK对Na+/H+交换蛋白的活化主要是引起应力纤维的收缩和黏附斑的形成，但确切的形成机制仍不清楚[24]。

4.IQ结构域GTP酶活化蛋白1（IQdomain GTPase-activating protein 1，IQGAP1）

IQGAP1是Rac1和Cdc42另一个效应分子，通过β-连接蛋白/E-钙黏蛋白复合物参与调控钙黏蛋白依赖性的细胞间粘附[25]。IQGAP1的N末端有4个可参与钙调蛋白相互作用的IQ模体，因此说明IQGAP1参与钙离子介导的信号过程。Par6是Cdc42和Rac1的下游分子。Par3，Par6和PKCζ组成复合物起支架蛋白的作用，与上皮细胞的紧密连接有关。研究发现，糖原合成酶激酶（glycogensynthase kinase-3β，GSK-3β）与Par6-Par3-pKζ组成复合物转导Cdc42下游信号，Cdc42能促进GSK-3β的磷酸化从而抑制其活性。在GSK-3β的作用下，APC发生磷酸化与微管蛋白末端相结合而聚集到迁移细胞的前端，从而影响肿瘤的发生发展[26-27]。

二、Rho GTPase的生物学特性

目前，普遍采用细菌毒素来研究Rho GTPase的生物学活性。例如，来源于肉毒杆菌的胞外酶C3通过天冬胺酸ADP糖基化作用特异性抑制了类似RhoA的其他亚型（如RhoA、RhoB、RhoC），从而减弱了Rho GTPase的生物活性。据报道这是由于Rho/GDI复合物对Rho的俘获作用。另外来源于艰难梭菌大量毒素的胞外酶C3通过Rho第37位苏氨酸的糖基化来抑制Rho、Rac和Cdc42的功能，Rho的糖基化作用阻滞了与其效应物的偶联。应用持续活化型或主导抑制型Rho的突变体也可用于进一步研究Rho的调节过程。在Rac1第12位密码子和RhoA第14位密码子将颉氨酸替代为苷氨酸时可成为持续活化性Rho的突变体，这个诱导突变体防止了GAP催化GTP的水解作用。然而，在Rac第17位密码子上苏氨酸替代天门冬氨酸并不能影响Rho与GEFs的结合，形成的复合物也不能产生下游效应[28]。

实验研究可以看出Rho GTPase的主要功能是调节肌动蛋白细胞骨架的重建。例如，Rho蛋白对于肌动、肌球蛋白收缩的形成，粘着斑的黏附是最基本的。生长因子，比如PDGF、EGF和胰岛素都能通过激活Rac来诱导肌动蛋白层形板足的形成和细胞膜皱褶的形成。了解Rho、Rac和Cdc42在肌动肌球蛋白丝形成中的作用，就很容易理解Rho GTPase在肌动蛋白细胞骨架集合和解离过程中所起的重要作用，如胞质的分裂，吞噬作用和细胞迁移[29-33]。另外，钙粘连素和E-选择蛋白介导的细胞与细胞的接触、整合素和细胞外基质的接触、细胞周期G1/S期过程、细胞的转化，NADPH氧化酶活性、NO的生成、磷脂酶活性以及细胞凋亡和存活都与Rho蛋白功能有关。同时Rho GTPase也参与一系列与细胞肌动蛋白骨架无关的细胞生物化学通路的活性调节，这些通路调节着MAP激酶的活性，尤其是N末端c-Jun激酶/应激活化蛋白激酶和p38激酶以及许多转录因子，如血清反应因子、激活物蛋白-1、核转录因子和STAT蛋白[34]。

已有30多种Rho蛋白下游作用物分子被确认，每种Rho蛋白可以和不同的下游蛋白起作用。Rho蛋白的Rho-GTP结合形式可以通过与不同的底物分子结合而启动下游不同的反应。从Rho蛋白与GDP或GTP结合的构象分析可以看出有两个区域不同，开关Ⅰ（Rac或Cdc42的26～45位氨基酸）和开关Ⅱ（Rac或Cdc42的59～75位氨基酸），这样的结构表明这些区域是Rho结合底物分子的重要部位。进一步观察到当Rac第40位酪氨酸突变为半胱氨酸时可以阻断Rac和PAK的结合。相反当第37位苯丙氨酸被丙氨酸取代时并不能减弱PAK的作用，这提示每个Rho残基与下游结合区域决定了其独特的作用物分子[7]。既然开关区域的点突变并不能阻止所有与靶蛋白的结合，所以开关Ⅰ或开关Ⅱ以外的区域决定了与底物分子的特殊结合。如，Rho第143～175位氨基酸认为是结合p67phox和激活PAK的重要部位[35-37]。

三、Rho GTPase与肿瘤

肿瘤细胞侵袭和转移特性决定了恶性肿瘤的转化、进展和转移，而这些特性又有细胞基因表达来控制。癌基因激活或抑癌基因功能的丧失导致肿瘤细胞增殖旺盛，而瘤细胞的凋亡则需要其他旁路，瘤细胞的凋亡常常是丢失黏附力的结果。大多数恶性肿瘤都来源于上皮细胞，从正常细胞向侵袭表型的过渡即所谓“上皮向间质细胞的转型”，这个过程有细胞本质的变化，包括黏附特性、肌动蛋白骨架的重组和细胞外基质蛋白的分泌[38]。这些变化常常是细胞基因表达变化的结果，Rho GTPases家族在这些变化中起了非常重要的作用。研究发现E-钙粘蛋白和E-选择蛋白介导的细胞之间的接触都需要Rho GTPase的参与。E-钙粘蛋白介导的细胞之间牢固结合的分解是细胞获得移动性的前提条件[39]。E-选择蛋白介导的细胞之间的接触对于循环肿瘤细胞的外渗是很重要的，因此其能促进肿瘤细胞的转移。另外，介导肿瘤细胞转移和生长的基质金属蛋白酶也依赖Rho蛋白的调控。研究发现不同整合素调节细胞与胞外基质的去黏附和再黏附是侵袭性肿瘤细胞的另一特性，同样也需要活性Rho、Rac和Cdc42的协调。各种重组肌动蛋白分子的相互作用对于黏附的作用也是必需的。上述这些机制都有赖于Rho GTPases和其下游底物蛋白的相互调节[40]。

Rho GTPases除了调节细胞肌动蛋白之外，还主要调节经过G1期的细胞周期进程，因为其调节细胞周期蛋白D1和细胞周期激酶依赖性抑制剂p21和p27，Rho GTPases自身表现出的转化活性是Ras介导的肿瘤基因转化的基础。最近研究表明RhoA通过调节STAT3和STAT5而调节细胞的迁移、增殖和EMT（上皮向间质细胞的转型）。Rho蛋白还影响肿瘤血管的发生和细胞的凋亡，体内外都有很好的证据来说明Rho GTPases与肿瘤的进展和侵袭有关，尤其是RhoA和RhoC[41-43]。体外Rho底物蛋白的抑制剂能明显减弱细胞的侵袭能力。研究发现RhoA、Rac2和Cdc42在头颈部肿瘤表达明显增加；Rho mRNA和／或蛋白表达水平与胰腺癌、胃癌以及睾丸细胞肿瘤的恶性程度有关；乳腺癌和大肠癌表现出Rac1突变体Rac1b的表达增加。然而在脑部肿瘤Rho表达水平和恶性程度呈现出相反的关系。目前对人类肿瘤的研究表明，肿瘤进展过程中有Rho家族成员表达水平的变化，在肿瘤进展和侵袭性的不同阶段Rho的活性状态有时间依赖和空间依赖的关系。研究表明Rho GTPases几乎参与了肿瘤细胞进展和发展的每一个过程[44]。因此，干预Rho蛋白成为最有希望的肿瘤分子治疗的靶点。

四、干预Rho GTPase的方法

研究发现，目前干预Rho GTPases功能的方法主要包括下列几种。

1.Rho GTPases碳末端异戊二烯化抑制剂。Rho GTPases碳末端有个CAAX盒子结构，其决定是哪一种异戊二烯残基连在上面。蛋白质异戊二烯化需要合适的细胞内定位和GTPase的功能，包括Rho和Ras。Rho蛋白能够接受法尼基修饰和香叶基修饰，而Rho、Rac和Cdc42 GTPases只能接受香叶基修饰。凡能弱化Rho GTPases碳末端异戊二烯化的物质均可作为Rho蛋白很好的抑制剂。研究发现，通过抑制异戊二烯基转移酶可以降低Rho蛋白碳末端脂质化修饰。实验中还观察到，异戊二烯基转移酶抑制效应仅限于一个特殊的小Rho GTPase亚家族，而不是对每一个Rho GTPase都有特异性[45]。HMG-CoA还原酶抑制剂减少了细胞内异戊二烯基前身物，其不但能降低体内胆固醇水平，而且还能抑制Rho GTPase的作用。最初，只知道HMG-CoA还原酶抑制剂通过减少异戊二烯化前身物来降低体内胆固醇，而不知道其在体内外抗肿瘤转移的重要特性。

2.抑制Rho GEF的活性。选择Rho GEF抑制剂最理想的结果是其只抑制某一个Rho GTPases而不影响Rho其他亚型的活性。达到此目的方法：（1）通过选择性抑制剂合成物来抑制Rho激活蛋白的活性，（2）通过化学合成药物直接与某个Rho GTPases作用以阻断GDP向GTP的交换从而阻断下游效应物的反应。对于第一种方法研究已知Rho GEF有交叉作用的特点，如Rho鸟苷酸交换因子Vav和Db1作用于Rac和RhoA时能催化GDP向GTP的交换活性，而Cdc42是不是Vav和Db1的作用底物仍不清楚。另外Tiam1激活的是Rac而不是Rho，尽管鸟苷酸交换因子对于Rho GTPases亚家族的特异性还不完全清楚，但是Rho GEF作为一个靶点来抑制已知的Rho GTPases亚家族还是一个合适的方法，同时不影响Ras超家族的其他成员[46]。

3.抑制Rho效应蛋白的活性。Rho蛋白通过与不同的效应物作用启动不同的下游反应，因此，通过药物阻滞Rho与某一效应物的结合或抑制某一Rho效应蛋白的活性应该是最具有特异性的。Rho GTPases的晶体结构和Rho效应物分子的精确结合以及结合后Rho效应物结合域的功能特性都可以使Rho蛋白的功能加强或出现抑制。Y-27632是这种化学合成物的代表，其能特异性抑制Rho相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ROCK家族的活性，这个家族是Rho GTPases特异的下游效应物。动物模型中Y-27632能明显降低肿瘤的转移，这一事实说明了ROCK激酶抑制剂作为抗肿瘤药物的可能性。体外研究最近报道一种新的ROCK抑制剂Wf-536，其能抑制肿瘤血管发生、肿瘤生长和肿瘤转移[47]。还有ROCK激酶抑制剂复合物H-1152p和Fasudil，后者已用于治疗脑血管痉挛。在ATP竞争性抑制剂中，H-1152p是最有特异性和最有抑制效应的ROCK抑制剂。H-1152对ROCK的抑制常数处在Nanomolar范围的低值，其比Y-27632或Fasudil抑制常数低数百倍。在ROCK和ATP结合部位有一特殊的氨基酸残基，其被认为是ROCK抑制剂高选择部位。然而，对Y-27632和Fasudil特异性进一步分析，在30多种不同的蛋白激酶抑制剂中，这2种复合物能像抑制ROCK一样也能抑制PRK2，其他蛋白激酶包括PKA、PKCα和MAP激酶只受轻度影响。因此，从研究Fasudil或Y-27632获得的结果表明这2种复合物不但抑制ROCK而且也抑制了PRKs。多年研究表明高效特异的蛋白激酶抑制剂为丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂，而2种激酶抑制剂的结合则认为是未来改善肿瘤治疗的最好方法[48]。

五、展望与结论

Rho蛋白参与了调节细胞的许多功能，包括与细胞转移有关的特性。研究表明通过抑制Rho蛋白的功能来抑制肿瘤细胞的转移是一个很有前途的策略，Rho蛋白在调节细胞对传统抗肿瘤药物的反应方面也起了主要作用。事实上Rho蛋白的抑制调节了肿瘤细胞或正常细胞对于抗肿瘤药物和电离辐射致DNA损害的敏感性。因此，研究和发现新的Rho抑制剂的药物可以提高肿瘤治疗疗效。能够作为Rho蛋白的药物包括：（1）Rho蛋白碳末端异戊二烯化抑制剂；（2）化学合成物封闭Rho GEF活性和/或干扰Rho与GEF的结合；（3）药物直接作用Rho蛋白使GDP不能交换为GTP或者影响与下游底物的结合；（4）药物特异的抑制某一Rho底物蛋白[49-51]。以研究Rho GTPases为基础，发展新的靶向抗肿瘤药物将是我们今后努力工作的方向。

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Rho GTPases and tumor

Chen Baodong,Xu Ruxiang.Affiliated Bayi Brain Hospital,The Military General Hospital of Beijing PLA,Beijing 100700,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

Cell migration to participate in the organization form,embryonic development, inflammation,wound healing,such as a variety of physiological and pathological process of atherosclerosis,and throughout the whole process of tumor metastasis.Cell migration to extracellular and intracellular signaling molecules regulate cytoskeleton power unit for driving force,and actin cytoskeleton mediated adhesion between anchorage force provided by the coordinated operation.Small molecule Ras homologue(Rho)protein is to change the cytoskeleton assembly,regulation of cell migration and then the key factors of the involved in tumor metastasis.Rho GTPase played a key role in regulating tumor cell functions,including cell malignant transformation and migration.Members of the family of the reorganization of actin in regulating cell,mobile,cells and cells and cells and extracellular matrix adhesion,cell cycle,gene expression and apoptosis also play an important role in the process,in which each function in cancer occurrence and development are extremely important.Rho GTPase also can increase the susceptibility of cell DNA damage,including antineoplastic drugs and ionizing radiation,the Rho GTPase regulation can influence the effect of the traditional antineoplastic therapy and/or side effects,with Rho GTPase as the target,choose efficient specific Rho GTPase inhibitors can significantly increase the effect of anti-tumor therapy.

Ras homologue GTPase;Invasion and metastasis;Targeted therapy

2017-02-26）

（本文编辑：张丽）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.04.012

100700北京，陆军总医院附属八一脑科医院

徐如祥，Email：zjxuruxiang@163.com

陈宝东,徐如祥.Ras相似物GTP酶与肿瘤[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2017,3(4):234-239.