尼莫地平对蛛网膜下腔出血模型大鼠谷氨酸转运体表达的影响

王琳 王涛 梁迎春 宁方波 赵芳芳 张馨娜 张磊

尼莫地平对蛛网膜下腔出血模型大鼠谷氨酸转运体表达的影响

王琳 王涛 梁迎春 宁方波 赵芳芳 张馨娜 张磊

目的探究尼莫地平对蛛网膜下腔出血（SAH）模型大鼠脑干组织中谷氨酸转运体表达情况影响。方法选取54只Wistar大鼠，按照随机数字表法分为对照组6只，SAH组24只和SAH-尼莫地平组24只，使用枕大池二次注血法建立SAH模型，SAH-尼莫地平组注射尼莫地平，分别检测三组大鼠基底动脉的最大血流速度以及谷氨酸转运体（EAATs）mRNA表达水平。结果SAH组第1、7、14天的基底动脉最大血流速度（Vba）显著高于对照组，SAH-尼莫地平组第1、7天的Vba显著高于对照组，SAH-尼莫地平组在第1、7、14天的Vba显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。SAH组第1天的EAAT-1/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）显著低于对照组，第21天显著高于对照组；SAH-尼莫地平组4个时间点的EAAT-1/GAPDH值均显著高于对照组，第1、7、14天显著高于SAH组，差异均有统计学意义（P<0.05）。SAH组第1、7天的EAAT-2/GAPDH显著低于对照组，SAH-尼莫地平组第14、21天的EAAT-2/GAPDH显著高于对照组，4个时间点均显著高于SAH组，差异均有统计学意义（P<0.05）。SAH组第1、7天的EAAT-3/GAPDH显著低于对照组，SAH-尼莫地平组第1天的EAAT-3/GAPDH值均显著高于对照组，第1、7天显著高于SAH组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论使用尼莫地平可有效增加大鼠脑干中EAATs的表达水平，从而缓解脑血管痉挛，治疗SAH。

尼莫地平；蛛网膜下腔出血；谷氨酸运转体

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）又称为原发性SAH，是指脑底部或脑表面的病变血管破裂，血液直接流入蛛网膜下腔引起的一种临床综合征，约占急性脑卒中的10%[1,2]。SAH通常还会诱发脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS），SAH具有较高的死亡率，是一种非常严重的常见疾病[3]。谷氨酸是中枢神经系统中主要的神经递质之一，在维持正常的脑功能中起着重要作用[4]。谷氨酸通过离子型谷氨酸受体（ionotropic glutamate receptor，iG1uR）和促代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor，mG1uR）发挥作用，谷氨酸的清除途径为通过谷氨酸转运体（glutamate transporter，EAATs：EAAT1、EAAT2、EAAT3）转化为谷氨酰胺[5]。研究表明若谷氨酸水平过高与中枢神经细胞受损密切相关，EAATs则可清除活化的谷氨酸使其保持在一定的水平[6]。尼莫地平是治疗SAH最为常用的药物之一，其作用方式可能与提高EAATs的水平有关，但是尼莫地平的具体作用机制尚不完全明确[7]。本实验通过研究尼莫地平对蛛网膜下腔出血模型大鼠脑干组织中EAATs表达水平的影响，探讨其作用机制。

材料与方法

一、材料

采用枕大池二次注血法制备大鼠蛛网膜下腔出血模型：Wistar大鼠54只，其中雌性27只，雄性27只，体质量（250±20）g，按照随机数字表法分为3组，其中对照组6只；SAH组24只；SAH-尼莫地平组24只。每组均雌雄各半，每组大鼠体质量、性别等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

二、方法

SAH大鼠模型的制备方法为枕大池二次注血法，使用10%的水合氯醛对大鼠进行麻醉，剂量为0.35 mg/100 g，腹腔注射，麻醉起效后将其俯卧固定，将头部毛发去除，使用安尔碘消毒，在眼球后静脉丛抽取0.15 ml无抗凝自体血后向枕大池注射，48 h重复此过程，对照组则注射生理盐水[8]。建立SAH模型后0.5 h对SAH-尼莫地平组大鼠注射尼莫地平（Bayer Vital GmbH，国药准字J20050050），剂量为0.2 mg/kg，腹腔注射，之后每日注射一次，进行21 d。

三、观察指标

1.大鼠基底动脉血流速度：使用多普勒超声检测基底动脉的最大血流速度（maximum blood flow velocity of basilar artery，Vba），分别在开始注射尼莫地平的第1、7、14、21天进行，以此来判断大鼠CVS程度。

2.大鼠脑干组织中EAATs水平：检测3组大鼠脑干中EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA水平，使用RT-PCR法。在进行超声检查后，取脑干标本80 mg，提取RNA，通过逆转录得到cDNA，在进行PCR扩增。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物大小700 bp，序列GAPDH-F：5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTAT GT-3′，GAPDH-R：5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGA AGTC-3′；EAAT-1引物大小572 bp，序列：EAAT-1-F：5′-CCCGGAAGAACCCCTGGGTTT-3′，EAAT-1-R：5′-GTTCATTGTCCTGGGCAATCA-3′；EAAT-2引物大小为328 bp，序列：EAAT-2-F：5′-GGGTCATGCTGG ATGGAGGT-3′，EAAT-2-R：5′-CGTGTCGTCATAAAC GGACTG-3′；EAAT-3引物大小为572 bp，序列：EAAT-3-F：5′-GACTGGGAAATATTCCGCAACT-3′，EAAT-3-R：5′-CGCACAGCGGAATGTAACTGG-3′。反应条件：（1）变性：94℃，30 s；（2）退火：56℃，30 s；（3）延伸：72℃，30 s。其中GAPDH循环26次，EAAT循环35次。

四、统计学分析

使用SPSS19.0软件进行统计分析，性别以（百分数）的形式表示，统计分析采用χ2检验；体重、Vba，EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA表达水平及EAAT-2/GAPDH值的采用均数±标准差（）表示，采用成组t检验进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、3组大鼠Vba比较

与对照组相比，SAH组Vba发生了明显变化，第1、7、14天的Vba值显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第21天差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，SAH-尼莫地平组第1、7天的Vba显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第14、21天差异无统计学意义（P＞0.05）。与SAH组相比，SAH-尼莫地平组在第1、7、14天的Vba值显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；第21天差异无统计学意义（P＞0.05）。详细内容见表1。

二、大鼠脑干EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA表达水平

通过核酸电泳实验发现，对于EAAT-1，SAH组第1天的EAAT-1/GAPDH值显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第14、21天显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而SAH-尼莫地平组4个时间点的EAAT-1/GAPDH值均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且第1、7、14天显著高于SAH组，差异有统计学意义（P＜0.05）。具体内容见表2。

对于EAAT-2，SAH组第1、7天的EAAT-2/ GAPDH值显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而SAH-尼莫地平组第14、21天的EAAT-2/ GAPDH值均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且4个时间点均显著高于SAH组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体内容见表3。

对于EAAT-3，SAH组第1、7天的EAAT-3/ GAPDH值显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。而SAH-尼莫地平组第1天的EAAT-3/ GAPDH值显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且第1、7天显著高于SAH组，差异有统计学意义（P＜0.05）。具体内容见表4。

讨论

CVS是SAH的常见并发症，SAH可导致CVS从而阻碍脑部微循环诱发脑缺血，严重威胁着患者的生命健康。目前对于CVS的发病机制尚不完全明确，因此，探索CVS的发病机制对治疗SAH有着重大意义[9]。目前的研究表明，CVS的发病机制可能有很多，其中主要包括一氧化氮含量降低、内皮素-1含量的增加、氧合血红蛋白的局部血管收缩作用、蛋白激酶C过度活化、以及离子通道的活性变化等[10]。

谷氨酸作为神经体统中重要的神经递质，它的大量积累也是导致神经细胞受损的关键因素之一，也与SAH有着密切关系[5,6]。但细胞外液中没有可以代谢谷氨酸的途径，谷氨酸的清除只能通过EAAT摄取，因此EAAT水平也是CVS的重要原因。EAAT有三种亚型EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3，EAAT-1、EAAT-2主要存在于神经胶质细胞膜表面，EAAT-3主要存在于神经元细胞膜表面，他们可摄取谷氨酸从而防止其神经毒性作用[11,12]。尼莫地平是一种1,4-二氢吡啶类钙离子拮抗剂，容易透过血脑屏障，对脑组织受体有高度选择选性[13]。它可有效地阻止钙离子进入细胞，从而抑制平滑肌收缩，达到解除血管痉挛的目的[14,15]。

表1 3组大鼠基底动脉的最大血流速度比较（）

表1 3组大鼠基底动脉的最大血流速度比较（）

与对照组相比，aP＜0.05，其具体统计值为：ta1=7.485，P=0.000；ta2=11.635，P=0.000；ta3=4.452，P=0.000；ta4=4.982，P=0.000；ta5=8.364，P=0.000；与SAH组相比，bP＜0.05，其具体统计值为：tb1=3.755，P=0.004；tb2=7.326，P=0.000；tb3=6.853，P=0.000

SAH后1 d 7 d 14 d 21 d对照组6 25.42±4.26 25.67±3.56 26.36±2.86 25.73±3.75 24.76±4.53 SAH组6 25.19±4.86 40.35±2.64a155.85±3.64a234.73±4.68a325.67±6.76 SAH-尼莫地平组6 24.35±4.64 34.35±4.76a4b142.15±4.25a5b226.85±5.35b324.74±3.38组别只数SAH前

表3 3组大鼠谷氨酸转运体-2/甘油醛-3-磷酸脱氢酶比较

表4 3组大鼠谷氨酸转运体-3/甘油醛-3-磷酸脱氢酶比较

本研究发现，建立模型后，SAH组和SAH-尼莫地平组的Vba均显著升高，说明大鼠在建模后发生了CVS，并且和SAH-尼莫地平组的流速显著低于SAH组，说明尼莫地平的使用有效的缓解了大鼠的CVS的症状。同时还发现在SAH早期，SAH组的3种EAAT水平均显著低于对照组，说明EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA的表达水平在SAH早期显著下调，使得谷氨酸在细胞间质内累积。而SAH-尼莫地平组的EAAT-1、EAAT-2以及早期EAAT-3 mRNA的表达水平显著高于SAH组，说明尼莫地平的使用有效促进了3种EAAT的表达，增加神经原细胞及神经胶质细胞表面的EAATs，增加对谷氨酸的摄取，缓解CVS并治疗SAH，这与SAH-尼莫地平组的Vba显著低于SAH组的数据具有一致性。

综上所述，EAAT-1、EAAT-2和EAAT-3可能参与了大鼠CVS的形成，并且尼莫地平的使用可有效增加EAATs的表达水平，从而缓解CVS，治疗SAH，其具体机制有待于进一步研究。

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Effects of nimodipine on glutamate transporter expression of SAH model rats

Wang Lin,Wang Tao,Liang Yingchun,Ning Fangbo,Zhao Fangfang,Zhang Xinna,Zhang Lei.Department of Neurosurgery,Tai’an City Central Hospital,Tai’an 271000,China

Zhang Xinna,Email:57670593@qq.com

Objective To investigate the effects of Nimodipine on the expression of glutamate transporter in the brain stem of subarachnoid hemorrhage(SAH)rats.Methods Fifty-four Wistar rats were randomly divided into control group(n=6),SAH group(n=24)and SAH-Nimodipine group(n=24). SAH model was established by injecting blood twice.The level of glutamate transporter(EAATs)mRNA and the maximal blood flow velocity of basilar artery in rats were detected by injection of Nimodipine. Results The Vba of SAH group was significantly higher than that of control group at 1,7 and 14 d(P< 0.05).The Vba of SAH-Nimodipine group was significantly higher than that of control group at 1 and 7 d (P<0.05).The Vba of 1,7 and 14 d were significantly lower than those of the control group(P<0.05). EAAT-1/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)of SAH group was significantly lower than that of control group at 1 d(P<0.05),and 21 d significantly higher than that of control group(P<0.05). The EAAT-1/GAPDH of SAH-Nimodipine group was significantly higher than that of the control group at 4 time points(P<0.05);the 1,7 and 14 d were significantly higher than SAH group(P<0.05).The EAAT-2/GAPDH of SAH group was significantly lower than that of the control group at 1 and 7 d(P<0.05),and the EAAT-2/GAPDH of SAH group was significantly higher than that of SAH group at 14 d and 21 d after SAH-Nimodipine treatment(P<0.05).The EAAT-3/GAPDH of SAH group was significantly lower than that of the control group at 1 and 7 d(P<0.05).The EAAT-3/GAPDH of SAH group wassignificantly higher than that of SAH group at 1 and 7 d after SAH-nimodipine treatment(P＜0.05). Conclusion Nimodipine can effectively increase the expression of EAATs,thereby relieving cerebral vasospasm,treatment of SAH.

Nimodipine;Subarachnoid hemorrhage;Excitatory amino acid transporters

2017-03-05）

（本文编辑：张丽）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.04.009

271000泰安，山东省泰安市中心医院放射科

张馨娜，Email：57670593@qq.com

王琳,王涛,梁迎春,等.尼莫地平对蛛网膜下腔出血模型大鼠谷氨酸转运体表达的影响[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2017,3(4):226-229.