多菌种分段固态发酵制备高水解度豆粕蛋白饲料的研究

■刘建峰

（湖北轻工职业技术学院，湖北武汉730070）

豆粕是大豆经提取豆油后得到的副产品，蛋白含 量高达40%～50%，且营养丰富，是畜禽类动物理想的蛋白饲料来源。但豆粕中含有众多种类的抗营养因子[1]，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水苏糖、脲酶等，极大地限制了豆粕营养价值的利用。豆粕中这些抗营养因子的去除，主要的方法就是通过微生物进行发酵，将其水解或转化，以减小抗营养的作用。在发酵豆粕时，所用的微生物种类必须符合农业部规定的《饲料添加剂品种目录》中的微生物或在食品中允许使用的微生物，包括酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、黑曲霉、米曲霉等。发酵豆粕质量的评价方法NY/T 2218—2012中虽然给出了其质量技术指标，但并没有充分体现发酵豆粕的关键质量指标——蛋白质的水解程度。因为豆粕中蛋白类的抗营养因子的去除，主要是通过微生物产生的蛋白酶的水解作用，将其转化为小分子的蛋白质或多肽，从而消除或降低抗营养因子的作用。而蛋白质的水解度[2]（Degree of Hydrolysis，DH）可以较好的反映这个转化过程或结果。

在豆粕抗营养因子去除效果的研究中，有一些研究采用了蛋白质水解度的指标，如徐倩等[3]、刘唤明等[4]，虽然其研究结果显示可将豆粕蛋白的水解度提高到20%以上，但其采用方法是微生物发酵和外加酶的协同模式，成本较高。本研究拟以水解度为考察指标，采用枯草芽孢杆菌和黑曲霉分段发酵的方式，充分利用不同微生物的发酵特性[5-6]，消除或减小豆粕中蛋白质类的抗营养因子，并为工业化应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料

豆粕由东海粮油工业（张家港）有限公司提供，普通型豆粕粗蛋白含量≥44%；麦麸皮为市购；糖蜜由南宁糖业股份有限公司提供；其它试剂均为化学分析纯。

1.1.2 主要仪器

生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、高压蒸汽不锈钢灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、SVS-1300型净化工作台（上海跃进医疗器械厂）。

1.1.3 菌种

枯草芽孢杆菌F-11-06、黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12，由本实验室保藏。

1.1.4 培养基

PDA培养基：马铃薯20 g、蔗糖2 g、自来水100 ml，pH值自然（约 6.0），灭菌 121℃、20 min。

麦麸培养基：麦麸80%、豆粕18%、葡萄糖2%，灭菌121℃、20 min。

固态发酵培养基：豆粕85%、麦麸10%、糖蜜2%、稻草颗粒2%、自来水110%。

1.2 试验方法

1.2.1 黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12混合接种剂的制备

分别取对数期的在麸皮培养基上生长的黑曲霉F-11-08和PDA培养基上生长的酵母菌F-11-12，以2∶1（质量/体积）的比例混合，其中黑曲霉F-11-08的孢子浓度为108个/g，酵母菌F-11-12的细胞浓度为106个/ml。

1.2.2 菌株产蛋白酶酶活的测定（初步确定发酵温度和发酵时间点）

取对数期生长的菌种，接种到装有适量固态发酵培养基的罐头瓶（直径 10 cm、高 10 cm）中，厚度约2 cm，枯草芽孢杆菌分别在 30、33、36℃和39℃培养 72 h或真菌（黑曲霉和酵母）分别在22、25、28℃和31 ℃培养 72 h，然后在24、36、48、60 h和72 h取样，并测定蛋白酶酶活。

1.2.3 单菌株发酵豆粕的蛋白质水解度

根据1.2.1的结果，可获得相应的蛋白酶酶活最佳的温度点，然后分别对发酵24、36、48、60 h和72 h的样品，进行蛋白质水解度的测定。

1.2.4 多菌株分段发酵豆粕的蛋白质的水解度

根据1.2.2的结果，采用适宜的发酵温度，同时以发酵豆粕的蛋白质的水解度较高的发酵时间为参考，用响应面的试验设计方法（采用Design Expert 10），进行多菌株分段豆粕发酵进行优化，期望获得高蛋白质水解度的发酵豆粕。

1.3 检测方法

孢子数量的测定采用 GB 4789.15—2010食品安全国家标准中食品微生物学检验霉菌和酵母计数的方法；蛋白酶酶活的测定采用GB/T 23527—2009蛋白酶制剂的方法；水解度的测定采用甲醛滴定法[2]。

2 结果与分析

2.1 菌株产蛋白酶酶活的测定

不同的发酵温度对微生物蛋白酶酶活性有不同影响，图1显示了枯草芽孢杆菌F-11-06在30、33、36℃和39℃发酵下的蛋白酶酶活，其中，在发酵温度为33℃、发酵时间为60 h时，蛋白酶的酶活较高，达到305.6 U/g。60 h时，在发酵温度低于或高于33℃时，所产的蛋白酶酶活都出现了不同程度的降低，说明33℃是枯草芽孢杆菌F-11-06在本试验条件下的较适宜的产蛋白酶的温度。另外，图1也显示在发酵前期，随着初始发酵温度的提高，蛋白酶酶活也在增高，但在发酵后期逐渐下降，并低于适宜的发酵温度。图2也展示了类似的结论，即在发酵温度为25℃、发酵时间为60 h时，蛋白酶酶活较高，达到4 404.2 U/g。说明温度是微生物蛋白酶发酵的一个重要的参数，在不同的发酵温度下，产生的蛋白酶的酶活不同。同时值得关注的是，随着发酵时间的增加，蛋白酶的活性也增加，但增加到一定阶段，蛋白酶的活性出现了下降的趋势，下降的原因可能是随着微生物的大量繁殖，出现的营养的不均衡或代谢物的抑制等[7-8]。

图1 枯草芽孢杆菌F-11-06在不同发酵温度下的蛋白酶酶活

图2 黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12混合发酵在不同发酵温度下的蛋白酶酶活

2.2 单菌株发酵豆粕的蛋白质水解度

在2.1结果的基础上，分别检测了枯草芽孢杆菌F-11-06在发酵温度为33℃或黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12在发酵温度为25℃的发酵豆粕蛋白质的水解度，结果见图3。图3显示，黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12的发酵豆粕的蛋白质水解度可达6.8%，明显高于枯草芽孢杆菌F-11-06的发酵豆粕的蛋白质水解度（3.3%）。同时图3中蛋白质水解度最高的时间点也是蛋白酶酶活最高的时间点（见图1和图2），即60 h。说明，发酵豆粕蛋白质水解度的高低与蛋白酶的酶活有一定的关系。但随着发酵时间的增加，发酵豆粕蛋白质的水解度出现了下降的趋势，可能是在微生物发酵的过程中，会产生各种代谢产物，这些代谢产物间可能会产生相互的作用，如美拉德反应，蛋白质水解产物两端的活性基团可能参与了这些反应，从而造成了蛋白质水解度测定结果的下降。

图3 枯草芽孢杆菌F-11-06或黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12在适宜豆粕发酵温度下的蛋白质水解度

2.3 多菌株分段发酵豆粕的蛋白质的水解度

根据2.2的试验结果，采用Design Expert 10软件，进行了两段豆粕发酵工艺的优化试验研究，即先用枯草芽孢杆菌F-11-06发酵一定的时间，然后再接种黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12并发酵一定的时间。发酵温度为枯草芽孢杆菌F-11-06发酵阶段为33℃，黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12发酵阶段为25℃。试验的因素水平设计见表1，具体的试验设计及结果见表2。

表1 试验的因素水平设计

表2 具体的试验设计及结果

2.3.1 试验结果方差分析

对试验结果进行二次项模型的方差分析，结果见表3。二次项模型P值＜0.000 1，说明模型是显著的；一次项（A和B）的P值＜0.000 1，说明A因素和B因素对结果的影响极显著；二次项（AB、A2和B2）的P值＜0.000 1，说明A因素和B因素的交互影响显著。在二次方模型的失拟项中P值为0.638，即大于0.05，说明模型的失拟项不显著，即不需要对试验结果进行更高次方模型的模拟，即二次方模型是合适的。图4显示了模型的预测值与实际观测值的关系，从图4可以看出，实际观测值与预测值非常接近，这也间接说明二次模型是合适的。

表3 试验结果的方差分析

图4 模型预测值与实际观测值的关系

2.3.2 二次方模型方程的建立

由表3试验结果方差分析可知，本试验结果分析采用的二次方模型是合适的，可以建立如下的二次方方程：

为了验证所建立模型的拟合程度，进行了模型的可信度分析（见表4）。从表4模型的可信度分析中可以看出，Adj R2为0.996 5，说明以试验结果为依据建立的模型，计算出的数据可以覆盖99.65%的区域，即模型的拟合程度很好，且在试验参数的取值范围内，模型的Pred R2为0.993 2，说明实际观测值与模型的预测值的相关性很好，即建立的二次方程是合适的。

表4 模型的可信度分析

为了更形象地认识A和B因素（不同时间分段）对二次方程响应值（水解度）的影响，可以建立响应面图（见图5）。从图5中可以看出，响应值有最大值，且最大值在试验值设计覆盖的范围之内。

图5 模型的响应面图

2.3.3 预测和验证

为了得到响应值（DH，%）的最大值，根据所建立的模型进行了响应值最大值的预测，根据工艺的可操作性和操作的难易程度，我们选取了3组（见表5），并进行了验证试验。

表5 二次模型方程最大值的预测值

考虑到试验的实际情况和操作的可能性，对上述的3组数据进行了修正（见表6）。在验证试验中，每一个处理做3个平行，试验结果见表6。在表6中可以看出，虽然序号3有最大的响应值（22.5%），但其所需的发酵周期较长，共需要118 h（A：68；B：50），而序号2的响应值虽然为22.3%，但发酵周期只需97 h（A：69；B：28）。因此我们选择序号2作为我们的最终的优化试验结果。

表6 响应值最大值预测的验证

3 结论

在豆粕微生物发酵过程中，不同的微生物对豆粕蛋白质有不同的水解能力。在本试验研究中，枯草芽孢杆菌F-11-06对豆粕蛋白质的水解能力较弱，在33℃、60 h的发酵条件下，其DH只有3.3%，而黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12，在25℃、60 h的发酵条件下，DH达到6.8%。为了最大程度的消除豆粕中蛋白质类的抗营养因子，进一步提高豆粕蛋白质的水解度，我们进行了多菌种分段发酵试验研究，结果显示豆粕前期用枯草芽孢杆菌F-11-06发酵69 h（33℃），后期用而黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12发酵28 h（25℃），可将豆粕蛋白质的水解度提高到22.3%，这是单纯枯草芽孢杆菌F-11-06（60 h、33℃）发酵豆粕蛋白质水解度的6.8倍，是单纯黑曲霉F-11-08和酵母菌F-11-12（60 h、25 ℃）的3.3倍。多菌种分段发酵可以大幅度提高水解度的原因可能是微生物之间的相互协作的结果[9-10]。