基于主成分分析的膨化大豆品质评价

■ 李军国 杨 洁 姚怡莎 李 俊 牛力斌

（1.中国农业科学院饲料研究所饲料加工创新团队，北京100081；2.农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京100081）

大豆营养丰富，其中蛋白质和脂肪的含量很高，分别为35%～45%和15%～20%，并且含有人体需要的多种必需氨基酸和必需脂肪酸，用做饲料也是动物营养成分和能量的重要来源，但大豆中含有的多种抗营养因子（Antinutritional factors，ANFs）限制了大豆在饲料中的应用[1-3]。这些抗营养因子主要包括胰蛋白酶抑制因子（Trypsin inhibitor，TI）、抗原蛋白（Antigen protein）、低聚糖（Oligosaccharide，OS）、脲酶（Urease）、大豆凝集素（Soybean agglutinin）和兼性抗营养因子大豆异黄酮（Soy isoflavones，SI）和皂苷（Soy saponin，SS）等，会对大豆营养效价、生物效价、适口性等影响较大[4-6]。而最有效的消除大豆抗营养因子的热处理方式就是挤压膨化加工，它保留了大豆本身的营养成分，钝化了抗营养因子，改善了的适口性，提高了利用率[7-8]。目前，膨化大豆品质评价主要是集中在营养物质消化吸收率的提高和抗营养因子的失活方面，主要评价的指标为脲酶活性和蛋白质溶解度，由于脲酶活性与热敏性抗营养因子胰蛋白酶抑制因子间有较强的正相关关系，脲酶活性越低胰蛋白酶抑制因子含量越低[3]。脲酶对热非常敏感，只能作为膨化过程是否加热至合适程度评价指标。一般认为脲酶活性小于0.3 U/g时即可，当脲酶完全失活时，不能评判膨化大豆是否加工过度。蛋白质溶解度可以评价膨化大豆是否过熟，一般认为蛋白质溶解度在70%～85%之间较合适，高于85%说明加工程度不足，膨化大豆过生，大豆中的抗营养因子的含量较高；低于70%则说明加工过度，即过熟化，大豆中的蛋白质变性过度，造成氨基酸损失，消化吸收率下降[9-10]。生产企业在生产过程中一般仅对脲酶活性进行检测，而脲酶活性是否能够反应膨化大豆中其他抗营养因子的变化尚有待确认，缺乏相关的评价体系。

本研究对不同来源的膨化大豆进行品质评价，确定以下检测指标：蛋白质溶解度（Protein solubility,PS）、脲酶活性（Urease activity,UA）、胰蛋白酶抑制因子（TI）、β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin,β-Congly）、大豆球蛋白（Glycinin Gly）、棉籽糖（Raffinose,R）、水苏糖（Stachyose S）、大豆苷（Daidzein,DA）、黄豆黄苷（Glycitin,GL）、染料木苷（Genistein,GE）、异黄酮总含量（SI）、大豆皂苷（SS），分析不同评价指标间的相关性，并运用主成分分析法简化评价指标，构架评价体系，计算综合得分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料

2016年5月采集国内知名企业生产的膨化大豆样品73个。

1.1.2 主要仪器

高效液相色谱仪（LC-15C，配备 RID-10A示差检测器和紫外可见检测器，日本岛津公司），ZORBAX NH2色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美国 Agilent公司），C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美国Agilent公司），酶标仪（PowerwaveXS2，美国BIOTek），恒温培养箱（MCO-175，日本SANYO）；旋转蒸发仪（RE-2000，上海亚荣生化仪器厂），高功率数控超声波清洗器（KQ-400KDE，昆山市超声仪器有限公司），微波炉（G70F23NIP-M8，格兰仕微波炉电器有限公司），双层恒温培养振荡器（SPH-2012C，上海世平实验设备有限公司），高速离心机（CR22G，日本日立公司），恒温水浴箱（SB-9，日本 EYELA 公司），pH计（Orion Star A211，美国Thermo公司）。

1.1.3 主要试剂

胰蛋白酶抑制因子试剂盒、大豆球蛋白试剂盒、β-伴大豆球蛋白试剂盒，购自北京龙科方舟生物工程技术有限公司；水苏糖和棉籽糖标准品（纯度为99.5%），购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；异黄酮标准品（大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷），购自上海安谱实验科技有限公司；齐墩果酸标准品（纯度为99%），购自上海安谱实验科技有限公司；乙腈、甲醇为HPLC纯，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；试验用水为Millipore纯水系统（美国Millipore公司）制得的超纯水；氢氧化钠、尿素、盐酸、乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白溶解度的测定

蛋白溶解度的测定过程参照DB13T 812-2006。

1.2.2 胰蛋白酶抑制因子和抗原蛋白的测定

样品中的TI和抗原蛋白采用ELISA法进行定量检测，反应过程在生化培养箱中恒温（37℃）进行。称取一定量的样品（TI为0.1 g，抗原蛋白为0.3 g，精确至0.1 mg）于50 ml离心管中，加入30 ml提取液，于25℃振荡提取16 h，静置2 min，4 000 r/min离心5 min取上层液体，取上清液用1倍样品稀释工作液稀释70倍。取出酶标板条，将样品盒标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，经过加样、洗板、加酶标试剂、显色，加终止液后于450/630 nm双波下读取OD值。

按照公式：百分吸光率（%）=B/B0×100，计算吸光率，其中B是标准品或样品的平均吸光度值，B0是标准品（空白对照）的平均吸光度值。

校准曲线的绘制：以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，将样品的百分吸光率带入到标准曲线中，从标准曲线上读出对应的浓度，乘以稀释系数，即为样品中TI和抗原蛋白的实际浓度。

1.2.3 脲酶活性的测定

参照《饲料用大豆制品中尿素酶活性的测定》（GB/T 8622-2006），考虑到膨化大豆中脲酶活性较低，将称样量调整为0.50 g（精确至0.1 mg）。

1.2.4 低聚糖的测定

称取2.0 g（精确至0.1 mg）粉碎后的样品，按照1∶25 g/ml的料液比加入体积分数为70%乙醇水溶液，置于微波炉中加热至沸腾，取出冷却至室温，在转速5 000 r/min下离心10 min，倒出上清液，重复以上步骤，合并两次上清液，旋转蒸发浓缩至5～10 ml，用去离子水定容至25 ml，涡旋混匀，取1 ml置于2 ml离心管中，转速4 000 r/min下离心10 min。过0.22 μm滤膜，供上机使用。

HPLC色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX NH2色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：示差检测器；流动相：A 为乙腈，B 为超纯水，A∶B=70∶30（V/V）；进样量：20 μl；流速：1 ml/min；柱温：35 ℃。

标准曲线的绘制：以去离子水为溶剂配制浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/ml棉籽糖和水苏糖混合标准溶液，在上述色谱条件下分析，以浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 异黄酮的测定

大豆异黄酮的检测参考GBT 23788-2009，采用HPLC法，流动相做小幅度的改动，流动相A为纯乙腈，B为0.1%乙酸水溶液。检测器：紫外检测器；色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），流速：1 ml/min，检测波长：260 nm，进样量：10 μl，柱温：30 ℃。根据出峰时间三种大豆异黄酮依次为：大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷。

标准曲线的绘制：分别称取三种大豆异黄酮标品各20 mg，用甲醇（HPLC级）配制1 mg/ml的标准储备液，分别取0.5 ml标准储备液，用甲醇稀释至10 ml，得到50 mg/l的混合标准溶液。取混合标准溶液分别稀释至 5.00、2.50、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05、0.01、0.005 mg/l的混合标准溶液，上HPLC检测，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标做标准曲线。

异黄酮提取：称取1 g（精确至0.1 mg）膨化大豆样品，以一定的料液比加入提取液，在一定条件下浸提、离心，倒出上清液，重复以上步骤，合并两次上清液，减压浓缩，定容、离心，上清液过滤膜，供HPLC上机检测。

1.2.6 皂苷的测定

采用香草醛-高氯酸显色法检测，以大豆皂苷的苷元类似物齐墩果酸为标准对照品，采用分光光度法进行测量。按照一定的提取方法提取膨化大豆中的大豆皂苷并稀释至合适浓度，取200 μl提取液加入试管中，50℃下使用氮气吹干，在试管中加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml，置于60℃水浴上加热15 min，流水冷却，加冰醋酸5 ml，混匀，取200 μl加至酶标板，将酶标板置于酶标仪中在波长560 nm处测量OD值。

根据OD值计算提取液齐墩果酸含量，齐墩果酸与大豆皂苷的换算系数为2.2，故样品中大豆皂苷含量计算公式为M=m(齐墩果酸)×2.2。

标准曲线的绘制：称取齐墩果酸标准品50 mg，定容至50 ml，用甲醇（HPLC）配制1 mg/ml的标准储备液。精密吸取齐墩果酸标准溶液0、100、200、300、400及500 μl分别于具塞试管中，在50℃下氮气吹干，在试管中加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液（称取5 g香草醛加入100 ml冰醋酸中）0.2 ml，高氯酸0.8 ml，置于60℃水浴上加热15 min，流水冷却，加冰醋酸5 ml，混匀，取混匀后的溶液200 μl加至酶标板，将酶标板置于酶标仪中在波长560 nm处测量OD值。以吸光值为横坐标，含量为纵坐标做标准曲线。

1.3 数据处理

使用Excel 2007对数据进行统计分析，利用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，标记字母法表示组间差异显著性，然后进行主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 膨化大豆主要抗营养因子含量分析

膨化大豆主要抗营养因子含量结果分析见表1。

表1 膨化大豆主要抗营养因子含量分析

2.1.1 蛋白质溶解度

蛋白质溶解度在一定程度上决定了膨化大豆对畜禽生长性能影响，是膨化大豆的一项重要评价指标。膨化加工过程中的作用力破坏大豆中蛋白质的结构，使大豆蛋白中的可溶性蛋白含量降低，因此造成蛋白质溶解度的降低。周兵等研究发现，膨化大豆的蛋白质溶解度与膨化温度的在一定范围内呈负相关，即随着膨化温度的升高（由80～120℃时）蛋白质溶解度呈下降趋势，与蛋白质受高温后易产生变性从而影响其溶解度趋势一致[10]。姚怡莎测定了大豆原料中的蛋白质溶解度为88.10%[2]，在表1中可以看出，膨化大豆的蛋白质溶解度平均值为75.81%，中等变幅，变化范围为67.93%～87.46%，说明膨化大豆的蛋白质溶解度有所降低。

2.1.2 脲酶活性

脲酶活性也是膨化大豆重要理化指标之一，关乎膨化大豆的安全。脲酶是一种含镍的寡聚酶，能特异性地催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，其最适pH值为7.4。它对热敏感，在合适的温度、膨化压力下脲酶活性降至国家标准规定的上限值0.3 U/g以下。李素芬等研究发现，膨化温度在110～130℃条件下，膨化大豆中脲酶活性为0.06～0.38 U/g[3]。姚怡莎测定了大豆原料中的脲酶活性为8.76 U/g[2]，在表1中可以看出，膨化大豆的脲酶活性平均值为0.00 U/g，变幅较小，变化范围为0.00～0.01 U/g，远远低于比国家标准规定的0.3 U/g，由此可见，挤压膨化加工过程能够使大豆中脲酶接近100%失活，这与相关研究的结果一致[10-11]。

2.1.3 胰蛋白酶抑制因子

大豆中胰蛋白酶抑制因子主要包括两种：Kunitz型胰蛋白酶抑制因子（KTI）和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制因子（BBTI），它们在大豆中的含量分别为1.6%和0.4%。目前研究已经发现，BBTI分子对热、酸、碱的稳定性比KTI强，相关研究发现，BBTI在105℃干燥状态下或其0.02%水溶液在100℃下加热10 min仍能保持活性，而KTI在90℃短时加热即发生不可逆失活[12-15]。因此，与热有关的加工工艺都很容易使其灭活，如蒸汽处理、膨化、烘烤等[6]。李素芬等研究发现，随膨化温度的提高，大豆胰蛋白酶抑制因子呈对数降低，膨化温度90℃时失活25.42%，90～120℃失活速度最快，膨化温度超过120℃后失活减慢。膨化温度在110～130℃之间条件下胰蛋白酶抑制因子含量为5.59～14.85 mg/g，失活率为68.7%～88.2%[3]。干法膨化在100～140℃下胰蛋白酶抑制因子的含量能够降低74.8%～88.6%，且对温度升高胰蛋白酶抑制因子的失活程度变大[16]，与席鹏彬等的研究结果相一致[17]。姚怡莎测定了大豆原料中的胰蛋白酶抑制因子为74.1 mg/g[2]，在表1中可以看出，膨化大豆胰蛋白酶抑制因子的平均值为18.58 mg/g，说明膨化使胰蛋白酶抑制因子显著下降，但变幅较大，变化范围为5.40～32.60 mg/g，推断与KTI型胰蛋白酶抑制因子占总胰蛋白酶抑制因子的比率有关。

2.1.4 抗原蛋白

大豆抗原蛋白中免疫原性最强的为β-伴大豆球蛋白（11S）和大豆球蛋白（7S），这两种抗原蛋白占大豆总蛋白的30%～35%，占总球蛋白总量的70%左右，降低这两种蛋白的活性对提高大豆蛋白质利用率及降低动物的不良反应有重要意义[18-19]。一直以来，有关大豆致敏蛋白活性的检测，没有简单易行的方法，因而相关的研究较少。以往研究认为，单纯的加热处理对这类蛋白影响不大，尤其对β-伴大豆球蛋白，普通的加工方法不能很好地将它们去除。姚怡莎测定了大豆原料中的β-伴大豆球蛋白为306.8 mg/g，大豆球蛋白为110.2 mg/g[2]，在表1中可以看出，膨化大豆β-伴大豆球蛋白的平均值为26.45 mg/g，变幅较大，变化范围为3.10～79.50 mg/g，大豆球蛋白的平均值为52.9 5mg/g，变幅较大，变化范围为20.30～93.50 mg/g，但与大豆原料相比，抗原蛋白含量都有一定的降低。

2.1.5 低聚糖

棉籽糖和水苏糖的结构很稳定，单糖之间通过糖苷键结合，在100℃高温下也不易分解，对热很稳定，仅在酸性条件下稳定性稍降低，挤压膨化过程中的高温、高压以及剪切力的作用不足以破坏棉籽糖和水苏糖的结构，故含量基本不变。姚怡莎测定了大豆原料中的棉籽糖为9.18 mg/g，水苏糖为34.78 mg/g[2]，在表1中可以看出，膨化大豆棉籽糖的平均值为11.00 mg/g，变幅较大，变化范围为6.87～21.36 mg/g，水苏糖的平均值为32.17 mg/g，变幅较大，变化范围为21.85～39.39 mg/g，说明膨化加工对大豆中棉籽糖和水苏糖的影响很小。

2.1.6 异黄酮

大豆异黄酮有12种，分为3种游离型苷元和9种结合型糖苷，三种苷元即大豆素、黄豆黄素和染料木素，含量仅占大豆异黄酮含量的2%～5%，糖苷类有三种，分别为葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型，其中丙二酰基型占大豆中异黄酮含量的89%～92%，其中后两种葡萄糖苷型异黄酮在高温和光照条件下会发生分解生成更稳定的葡萄糖苷型异黄酮，膨化过程中的高温作用是异黄酮含量上升的重要因素。目前研究膨化加工对低聚糖、大豆异黄酮和皂苷的影响较少。姚怡莎测定了大豆原料中的大豆苷为645.76 μg/g，黄豆黄苷为 148.34 μg/g，染料木苷为467.41 μg/g，大豆异黄酮的平均值为1.33 mg/g[2]，在表1中可以看出，膨化大豆大豆苷的平均值为880.10 μg/g，变幅较大，变化范围为586.96～1 101.13 μg/g，黄豆黄苷的平均值为105.96 μg/g，变幅较大，变化范围为66.56～205.57 μg/g，染料木苷的平均值为606.65 μg/g，变幅较大，变化范围为409.33～750.70 μg/g，大豆异黄酮的平均值为1.65 mg/g，变幅较大，变化范围为1.15～1.99 mg/g，说明膨化加工使大豆异黄酮的含量有所增加。

2.1.7 皂苷

目前，一般将大豆皂苷分为4类，A族、B族、E族和DDMP族大豆皂苷，它们大多是以皂苷元与其他糖、糖醛酸或有机酸结合而成，皂苷元常见为五环三萜类及齐墩果酸型皂甙元，由于大豆皂苷的种类繁多，很难找到标准品，本研究中以齐墩果酸作为对照品检测大豆皂苷的含量。研究发现，DDMP族大豆皂苷在加热条件下能够发生转化生成A族和E族的皂苷元，这可能是膨化大豆中的皂苷含量比大豆中含量高的原因。姚怡莎测定了大豆原料中的皂苷含量为10.64 mg/g[2]，在表1中可以看出，膨化大豆皂苷的平均值为11.71 mg/g，变幅较大，变化范围为9.34～15.63 mg/g，膨化对皂苷的含量基本无影响。

2.2 膨化大豆主要抗营养因子主成分分析

主成分分析法的原理是利用降维的思想，通过研究指标体系的内在结构关系，把多指标转化成少数几个相互独立而且包含原有指标大部分信息的综合指标。其优点是确定的权数是基于数据分析而得到的指标之间的内在结构关系，不受主观因素的影响，而得到的综合指标（主成分）之间彼此独立，减少信息的交叉，使得分析评价结果具有客观性和准确性。

采用SPSS16.0分析工具，通过主成分分析得到相关系数矩阵、方差贡献分析表、主成分荷载矩阵和相应的特征向量，如表2、表3、表4所示。

表3 方差贡献分析

表4 各主成分的载荷矩阵和特征向量

由表2可知，膨化大豆各抗营养因子之间存在不同程度的相关性，说明其反应的信息有一定重叠。其中脲酶活性与大豆苷、染料木苷、大豆异黄酮呈显著正相关，与黄豆黄苷呈显著负相关；胰蛋白酶抑制因子与大豆皂苷呈显著正相关，与大豆苷、染料木苷、大豆异黄酮呈显著负相关；大豆球蛋白与黄豆黄苷、大豆皂苷呈显著正相关，与染料木苷呈显著负相关；水苏糖与染料木苷呈显著负相关；黄豆黄苷与大豆皂苷呈显著负相关。

每个主成分的方差即特征值，表示对应成分能够描述原有信息的多少，主成分特征值越大，其变量包含的信息就越多。由表3可知，前4个主成分的特征值大于1，累计贡献率为69.928%（＞85%），说明前4个主成分能够代表原来12个指标的信息。因此，可以将膨化大豆抗营养因子的12个指标综合成4个主成分。

成分矩阵经过旋转在3次迭代后收敛，见表4。根据表4，构建膨化大豆各主成分与抗营养因子之间的线性关系式，如式：

第一主成分：Z1=0.013X1-0.044X2+0.048X3-0.044X4-0.002X5-0.094X6-0.113X7+0.270X8-0.003X9+0.255X10+0.265X11+0.226X12

第二主成分：Z2=0.067X1-0.125X2+0.335X3+0.406X4+0.457X5+0.010X6-0.187X7-0.024X8+0.144X9+0.008X10+0.001X11+0.031X12

第三主成分：Z3=0.486X1+0.589X2-0.164X3+0.016X4+0.054X5+0.173X6+0.043X7-0.042X8-0.020X9+0.003X10-0.026X11+0.060X12

第四主成分：Z4=0.166X1-0.190X2-0.093X3+0.082X4+0.232X5-0.249X6+0.375X7-0.052X8+0.649X9+0.090X10+0.067X11-0.221X12

通过表4所示的主成分载荷矩阵，得到以每个载荷量来表示的主成分与对应变量的相关关系，通过计算得到主成分的表达式。

第一主成分的方差贡献率为30.712%，包含的信息量较大，主要提取了大豆苷、染料木苷、大豆异黄酮和大豆皂苷；第二主成分的方差贡献率为17.366%，主要提取了胰蛋白酶抑制因子、β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白；第三主成分的方差贡献率为12.801%，主要提取了蛋白质溶解度和脲酶活性；第四主成分的方差贡献率为9.049%，主要提取了棉子糖、水苏糖和黄豆黄苷。最后综合主成分的系数及其对应的方差贡献率，可以得到评价公式Z=0.307Z1+0.174Z2+0.128Z3+0.090Z4。通过评价公式计算出膨化大豆品质的综合得分，根据综合得分的排序，可以看出不同膨化大豆品质的优劣。

2.3 评价公式的验证

针对主成分分析得到的评价公式，随机在73个膨化大豆样品中抽取5个样品进行验证。因为本试验检测的是膨化大豆的抗营养因子指标，因此得分低的膨化大豆品质较好。由表5可知，膨化大豆的蛋白质溶解度在要求的70%～85%之间，脲酶基本失活，但品质较好的产品其胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、大豆异黄酮的含量较低，与实际生产相吻合，评价公式可以用于生产中膨化大豆的品质评价。

表5 部分膨化大豆品质评价结果及排序

3 结论

本文研究测定了73个膨化大豆样品的蛋白质溶解度、脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、棉籽糖、水苏糖、大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、异黄酮总含量、大豆皂苷等含量，并对这12个评价指标进行了主成分分析。结果如下：

①膨化大豆蛋白溶解度、脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、棉籽糖、水苏糖、大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆异黄酮和大豆皂苷的含量范围为67.93%～87.46%，0.00～0.01 U/g，5.40～32.60 mg/g，3.10～79.50 mg/g，20.30～93.50 mg/g，6.87～21.36 mg/g，21.85～39.39 mg/g，586.96～1 101.13 μg/g，66.56～205.57 μg/g，409.33～750.70 μg/g，1.15～1.99 mg/g，9.34～15.63 mg/g。

②评价指标之间存在不同程度的相关性，其中脲酶活性与大豆苷、染料木苷、大豆异黄酮呈显著正相关，与黄豆黄苷显著负相关；胰蛋白酶抑制因子与大豆皂苷呈显著正相关，与大豆苷、染料木苷、大豆异黄酮呈显著负相关；大豆球蛋白与黄豆黄苷、大豆皂苷呈显著正相关，与染料木苷呈显著负相关；水苏糖与染料木苷呈显著负相关；黄豆黄苷与大豆皂苷呈显著负相关。

③通过主成分分析提取了前4个主成分，累计方差贡献率为69.928%，可以得到评价公式Z=0.307Z1+0.174Z2+0.128Z3+0.090Z4，计算出膨化大豆抗营养因子的综合得分，并进行验证，结果表明评价公式可以用于实际生产中膨化大豆的品质评价。