复合微生态制剂的制备及其对雏鸡生长性能的影响

■周亚强 崔一喆武 超 王 莹 吕庆博 唐清秀 史本栋 韦 雪

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

微生态制剂是指根据动物微生态学研制的用于调节动物体内微生态平衡、增强机体的免疫功能、调节肠道菌群的平衡、抵抗疾病、保证动物健康生长的一类微生物饲料添加剂[1]。它不仅具有营养保健作用，还可避免抗菌类药物等在动物体内的残留，是一类绿色环保健康的生物制品。近年来，微生态制剂的开发和应用对我国畜牧业的发展发挥了很大的积极作用。

活菌微生态制剂按照微生物的种类不同可分为乳酸菌制剂、酵母菌制剂、芽孢杆菌制剂及光合细菌制剂等。研究发现，在动物饲料中添加由酵母菌制备的微生态制剂可以通过调节动物胃肠道平衡，改善动物健康状态。乳酸菌制剂是指乳酸菌经过活化、培养、发酵冷冻干燥或喷雾干燥等一系列方法制备的一类活菌制剂，机体服用后可以改善胃肠道失调，使胃肠道处于平衡状态[2]。目前，动物用微生态制剂的生产方式有液态发酵和固态发酵两种。液态发酵易实现纯种培养，产品浓度高，但能耗高；固体发酵能耗低，产率较高。固态发酵技术在饲料行业的应用，是在最近几年才发展起来的，且工艺并不复杂，较易应用，但目前推广不好，主要由于已有的微生态制剂多用工业原料制备，很少有利用饲料原料做载体，且优化制备条件，即调制原料和发酵条件过程还不成熟，不能达到提高微生态制剂稳定性和活菌数量的目的。

本研究通过对动物来源的产朊假丝酵母菌和具有抑菌功能的乳酸菌的固体发酵原料配比和发酵条件进行研究，筛选出适合两种微生态制剂生长的最优固体发酵条件，制备出活菌数高的功能性微生态制剂，并将制备出的两种微生态制剂单独添加和按照1∶1的比例添加到雏鸡基础日粮中，探讨其对雏鸡生长性能的影响，为复合微生态制剂在雏鸡饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与菌液制备

产朊假丝酵母S2015J56和嗜酸乳杆菌S2014C37（Lactobacillus Acidophilus），由黑龙江八一农垦大学饲料资源开发实验室于2014～2015年从笼养蛋鸡盲肠中分离获得，纯化鉴定。

将保存的产朊假丝酵母S2015J56和菌种转接到PDA琼脂斜面培养基，35℃培养箱培养24 h，为一级种子液；将10 ml一级种子液接入115 ml PDA培养液中，35℃振荡培养24 h。用平板计数法测定菌液活菌数。将保存的乳酸菌菌种转接到MRS琼脂斜面培养基，30℃厌氧培养箱培养24 h，为一级种子液；将10 ml一级种子液接入115 ml MRS培养液中，30℃厌氧振荡培养24 h。用平板计数法测定菌液活菌数。

1.2 固体发酵原料配比的优化

以米糠为主要原料，玉米粉、豆粕粉、DDGS、稻壳、磷酸氢二钾、柠檬酸二铵、乙酸钠、硫酸镁为辅料，并分别按照L16（44×23）和L18（37）正交表，分配各因素及水平（见表1、表2）。

表1 产朊假丝酵母菌固体发酵原料L16（44×23）正交试验因素及水平

表2 嗜酸乳杆菌固体发酵原料L18（37）正交试验因素及水平

在无菌发酵料中，按料水比1∶1加入无菌水，加入6%的二级种子液混合均匀，放入培养箱，35℃培养72 h，45℃低温烘干。用平板计数法测定活菌数。

1.3 固体发酵条件的优化

1.3.1 发酵时间的确定

按照上述优化得到的发酵料配比，取100 g放入1 000 ml的大烧杯中高压灭菌后，按料水比1∶1加入无菌水，加入6%的二级种子液混合均匀，分别放入35℃培养箱（产朊假丝酵母S2015J56）和30℃厌氧培养箱（嗜酸乳杆菌S2014C37）培养。从24 h开始，每隔12 h取烘干样2 g，直到96 h，用平板计数法测定菌液的活菌数。确定适宜的培养时间。

1.3.2 其它发酵条件的优化

采用均匀设计，就发酵温度（A）、发酵料初始pH值（B）、发酵料水比（C）、接种量（D）、发酵料厚度（E）五个因素来优化发酵条件，发酵温度和发酵厚度设计10个水平，其他3个因素分别设计5个水平。根据混合水平均匀设计U10（102×53）表，并选择合适的因素水平混合一组，根据确定的适宜发酵时间取样，用平板计数法测定活菌数。

1.4 验证试验

通过正交试验设计得到的发酵料最优配比，结合产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌的生长曲线确定最佳发酵时间，和均匀设计优化得到的最适发酵条件，进行发酵验证试验。用平板计数法测定其活菌数。

1.5 动物饲养试验

1.5.1 试验动物与试验设计

试验选用240只1日龄健康的AA肉公鸡，平均体重为35.90 g，随机分为4组，每组5个重复，每个重复12只鸡，试验期28 d。其中，对照组饲喂基础日粮，试验组Ⅰ：基础日粮+1%产朊假丝酵母制剂；试验组Ⅱ：基础日粮+1%嗜酸乳杆菌制剂；试验组Ⅲ：基础日粮+1%产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌1∶1复合菌制剂。

1.5.2 试验日粮与饲养管理

AA肉仔鸡采用三层笼养，自由采食、饮水。鸡舍定期消毒，保证舍内清洁卫生干燥。饲养第1周舍内温度保持在33～35℃，随后每周降低2℃。按AA肉仔鸡常规程序进行免疫。饲养期间雏鸡基础日粮组成及营养水平见表3。

表3 肉仔鸡基础日粮组成及营养水平

1.5.3 测定指标及方法

①日增重

分别于第1、15、29 d清晨对试验雏鸡逐只进行空腹称重，并计算平均日增重（ADG）。

②料重比

试验期间计录每只雏鸡每天的采食量，计算其料重比。料重比=每只鸡的耗料量/每只鸡的体增重。

1.6 数据统计分析

微生态制剂条件优化采用SAS10.2软件进行回归分析，建立多元线性回归方程，对回归方程进行方差分析，检验其可信度。动物试验数据采用Excel 2013建立数据库，利用SPSS19.0统计软件中的单因素ANOVA法进行显著性分析，并采用Duncan's法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。测定结果以“平均值±标准差”形式表示。

2 结果

2.1 二级种子液活菌数

利用平板计数法测定产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌的二级种子液的活菌数分别为1.79×109CFU/ml和4.35×109CFU/ml。

2.2 正交设计优化发酵原料配比结果

产朊假丝酵母菌固体发酵原料L16（44×23）正交试验结果分析见表4。由于选用L16（44×23）混合正交表，各因素的水平数不等，所以极差不具有可比性。因此经过方差分析，结果见表5，显示因素A和C的P值分别为0.031 5和0.034 6，达到显著水平；D、E、F、B的P值分别为0.050 1、0.056、0.056 6、0.058 9。由此得到各因素对试验指标的影响程度排序：A＞C＞D＞E＞F＞B，即玉米粉＞豆粕粉＞DDGS＞磷酸氢二钾＞硫酸镁＞稻壳。各因素选取水平为：A3B2C3D4E2F1，即玉米粉15%，稻壳5%，豆粕粉15%，DDGS 22.5%，磷酸二氢钾0.1%。

表4 产朊假丝酵母菌固体发酵原料L16（44×23）正交试验结果

表5 产朊假丝酵母菌固体发酵原料L16（44×23）正交试验方差分析结果

嗜酸乳杆菌固体发酵原料L18（37）正交试验结果见表6。表6中各因素的极差可以看出各因素对活菌数的影响程度按顺序从大到小排列为：DCBAGEF，即：柠檬酸二氨＞DDGS＞豆粕粉＞玉米粉＞硫酸镁＞乙酸钠＞磷酸氢二钾；各试验因素的添加水平为：A2B3C3D2E3F1G2，即玉米粉10%，豆粕粉20%，DDGS 20%，柠檬酸二铵0.1%，乙酸钠1%，硫酸镁0.025%。由表7可知，经过方差分析，结果显示试验中7个因素的P值都大于0.05，不能断定7个因素都不显著，可剔除最不显著的因素。本试验中因素A到因素G的P值分别为0.593 2、0.415、0.271 7、0.586 8、0.868 8、0.749 5和0.814 7，其中因素E、F、G是最不显著的因素，分别剔除E、G、F做进一步分析，结果见表8。因素A到D的P值分别为0.322 5、0.140 2、0.049 5和0.314 6。根据显著性分析，因素C是影响试验结果的最重要因素，因此总体7个因素的重要程度排列为：C＞B＞D＞A＞F＞G＞E。最终确定嗜酸乳杆菌固体发酵原料的最佳配比为：米糠48.9%、玉米粉10%、豆粕粉20%、DDGS 20%、柠檬酸二铵0.1%，乙酸钠1%，硫酸镁0.025%。

表6 嗜酸乳杆菌固体发酵原料L18（37）正交试验结果

表7 嗜酸乳杆菌固体发酵原料L18(37)正交试验方差分析结果

表8 嗜酸乳杆菌固体发酵原料L18(37)正交试验4因素方差分析

2.3 发酵时间对产朊假丝酵母和嗜酸乳杆菌活菌数的影响

在固体发酵料营养成分一定的条件下，发酵料中菌的数量符合生长曲线的规律，会依次出现调整期、对数期、稳定期和衰亡期。微生态制剂是活菌制剂，因此发酵时间应控制在稳定期的初期，以便得到最大菌数，本试验目的就是找到这个点。不同发酵时间产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌活菌数如图1、图2所示。

图1 发酵时间对产朊假丝酵母活菌数的影响

图2 发酵时间对嗜酸乳杆菌活菌数的影响

由图1可以看出，接种酵母菌发酵的前36 h菌数的变化不大，发酵48～72 h菌数大量增长，72 h时达到最大，之后菌数的增长趋于平缓，因此，发酵时间定为72 h。

从图2可以看出，乳酸菌发酵的0～36 h为延滞期，活菌数变化不是很明显，从36 h后开始进入对数增长期，菌数迅速上升，到60 h达到最高峰，随后进入了稳定期。因此，嗜酸乳杆菌的最佳发酵时间为60 h。

2.4 发酵条件优化结果

根据均匀设计表U10（102×53）和U10（108）设计的因素水平组合，做发酵试验测定各组合的活菌数。结果见表9、表10。

表9 产朊假丝酵母菌发酵条件U10（102×53）均匀设计试验结果

表10 嗜酸乳杆菌发酵条件U10（108）均匀设计试验结果

根据表9中试验结果，采用SAS10.2软件进行回归分析，得到多元线性回归方程：Y=14+0.06X1-0.09X2-0.26X3-2.49X4-0.03X5和Y=125.9-4.46X1+2.67X2-7X3+9.5X4+6.9X5。为检验其可信度，对该回归方程进行方差分析，结果显示P值=0.258 8＞0.05，R值=0.715 6，说明该回归方程不显著，与试验数据拟合得不好。因此，对试验结果用SAS10.2软件进行逐步回归，得到方程Y=57.9-13X3-0.02X1X2-0.29X2X3，对该回归方程进行方差分析，分析结果显示P值=0.004 4＜0.05，R值=0.99，说明该回归方程极显著。

方程中不含有X4、X5（在逐步回归的过程中剔除），表明其取值变化对方程没有影响；X1、X3的系数为负，表明试验结果随因素水平的增加而减小。根据回归方程，在均匀试验设计范围内，设定自变量的取值精度，经计算机循环计算和对影响因素的综合考虑，最终确定方程的最佳组成为：X1=33，X2=25，X3=5.5，X4=1，X5=4%。按照最优配比，即发酵温度33℃，发酵料厚度25 cm，发酵料初始pH值5.5，发酵料水比为1∶1，发酵料接种量4%。

根据表10中试验结果，采用SAS10.2软件分析系统进行回归分析，得到多元线性回归方程：Y=125.9-4.46X1+2.67X2-7X3+9.5X4+6.9X5。为检验其可信度，对该回归方程进行方差分析，结果显示F值为10.14，P值=0.021 7＜0.05，调整系数为0.835 5，说明该回归方程是非常显著的，与试验数据拟合得很好。由回归方程可知：X2、X4、X5系数都为正，表明试验结果随因素水平的增加而增加；X1、X3的系数为负，表明试验结果随因素水平的增加而减小。根据回归方程，在均匀试验设计范围内，设定自变量的取值精度，经计算机循环计算和对影响因素的综合考虑，最优试验方案各因素的主次顺序为X5＞X2＞X3＞X1＞X4（P值分别为：0.06、0.099 3、0.128 8、0.214 7、0.982 7）确定方程的最佳组成为：X1=31，X2=35，X3=6.5，X4=1.4，X5=0.08。按照最优配比，即发酵温度31℃，发酵料厚度35 cm，发酵料初始pH值6.5，发酵料水比为1.4，发酵料接种量8%。

2.5 验证试验结果

按照优化得出的各种发酵料的配比以及均匀设计优化出的最优发酵条件，用大的发酵槽做三次验证试验。最终产朊假丝酵母固体发酵的活菌数稳定在1.05×1010CFU/g，嗜酸乳杆菌固体发酵的活菌数稳定在3.7×1010CFU/g。这一结果符合国家有关主管部门颁布的《微生态制剂的制造、检验暂行规定（大纲）》要求的菌制剂活菌数大于等于1×107cfu/g的规定。

2.6 复合微生态制剂对雏鸡生产性能的影响

复合微生态制剂对雏鸡生产性能的影响的结果见表11、表12。

表11 乳酸菌制剂对雏鸡日增重的影响(g)

表12 乳酸菌制剂对雏鸡料肉比的影响

由表11可知，在1～2周，复合添加剂组的雏鸡日增重显著高于其他三组（P＜0.05），而其他三组间差异不显著（P＞0.05）。在3～4周和整个育雏期（1～4周）三个试验组的雏鸡日增重显著高于对照组（P＜0.05），且复合微生态制剂添加组的雏鸡日增重分别显著高于单独菌制剂添加组（P＜0.05）。

由表12可知，在1～2周四个组的雏鸡料肉比均不显著（P＞0.05）；在3～4周和整个整个育雏期（1～4周），复合微生态制剂添加组的雏鸡料肉比显著低于对照组（P＜0.05），但与单独菌制剂添加组相比均无显著差异（P＞0.05）；单独菌制剂添加组间以及与对照组间相比，雏鸡料肉比均无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 复合微生态制剂的制备

微生态制剂具有调节效应是由于微生态制剂含有活的益生菌，微生态制剂中的活菌只有达到一定的量，才能更好地发挥作用。目前微生态制剂存在的主要问题是活菌数低，研制的微生态制剂远远达不到国家规定的标准。微生态制剂所含水分含量的高低也是影响微生态制剂产品质量的重要因素之一，微生态制剂中活菌存活率与微生态制剂水分含量成反比。通常情况下，微生态制剂所含水分越高，微生态制剂的稳定性就越低，导致微生态制剂活菌数降低[3]。国际上要求研制出微生态制剂产品活菌总数需达到1010CFU/g才能发挥微生态制剂的调节作用[4]。我国受到研究条件的限制，生产的微生态制剂产品的质量还远低于国际水平，很难达到理想的调节作用，制备工艺研究一直是微生态制剂的研究重点。

史洪涛等(2016)利用豆粕、红糖等发酵益生菌，其活菌数达到7.13×109CFU/g，其试验简洁选择2种培养底物，并建议选择如玉米粉、麸皮等更多营养成分加入培养基中并进行优化，使其更加适合乳酸菌的生长[5]。而任科润(2014)采用麸皮、玉米皮、豆粕为主要原料，采用固态发酵技术，对益生菌的发酵工艺进行研究，结果显示，发酵温度34℃、接种量12%、含水量50%条件下发酵60 h，菌数可以达到39.8×108CFU/g[6]，虽然高于国家《微生态制剂的制造、检验暂行规定（大纲）》要求的活菌数≥1×107CFU/g的规定，但未达到史洪涛提议加入豆粕等成分后活菌数提高的目的。分析原因与菌的来源和种属有一定关系。而本研究从动物源性分离得到的产朊假丝酵母和乳酸菌为嗜酸乳杆菌（其产酸能力较高，抑菌活性明显），采用玉米粉、麸皮、豆粕、米糠等饲料原料做培养底物进行产朊假丝酵母菌制剂的发酵工艺研究，使产朊假丝酵母固体发酵的活菌数稳定在1.05×1010CFU/g，嗜酸乳杆菌制剂的活菌数量达到3.7×1010CFU/g。不仅较史洪涛研究深入了一步，而且较任科润研究的活菌数提高了100倍，并提出包括水分含量调节的固态发酵方法，更是满足国际标准活菌数达到1010CFU/g的要求，为该菌制剂的进一步研究与应用打下良好的工艺基础。

3.2 复合微生态制剂对雏鸡生产性能的影响

随着人们对微生态制剂不断地深入研究，众多研究结果表明，日粮中添加微生态制剂对肉鸡的生长性能具有一定改善作用[7]。在畜禽日粮中添加微生态制剂不仅能改善适口性，提高饲料转化效率，还可以增强动物机体的抗病力和免疫力，减少疾病的发生[8]。文正常等(2016)研究表明，饲喂复合微生态制剂可极显著提高雏鸡日增重和降低料肉比[9]。R.Kalavathy等(2008)和徐海燕等(2013)在研究复合微生态制剂对肉鸡生长性能等的影响时发现，在肉鸡日粮中添加乳酸菌可使肉鸡体重、平均日增重等显著提高[10-11]。Giang等报道，在猪生长过程的日粮中添加复合微生态制剂，能提高其饲料转化效率、生长性能以及养分消化率[12]。沈素芳等研究表明，添加微生态制剂能够显著提高肉仔鸡的平均日采食量和平均日均增重(P＜0.05)[13]。陈功义等(2015)研究表明，当乳酸菌微生态制剂的添加量在5×106CFU/d时，11和19日龄乳鸽的平均日增重、末重最高，料重比最低，这表明乳酸菌微生态制剂能够显著提高乳鸽的生产性能[14]。在本试验中，复合微生态制剂添加组的雏鸡料肉比在各个时期均显著低于对照组（P＜0.05），日增重在各个时期均显著高于对照组(P＜0.05)，而在3～4周和1～4周时，产朊假丝酵母单独添加组和嗜酸乳杆菌单独添加组的雏鸡日增重也显著高于对照组(P＜0.05)，这同样也证明了在雏鸡的基础日粮中按照一定比例添加微生态制剂，可以提高肉仔鸡的生长性能。

4 结论

本试验经过重复检测，成功验证出产朊假丝酵母固态发酵菌制剂和嗜酸乳杆菌制剂活菌数最高的发酵底物配比及最优发酵条件，在此条件下产朊假丝酵母菌固体发酵的活菌数稳定在1.05×1010CFU/g，嗜酸乳杆菌固体发酵的活菌数稳定在3.7×1010CFU/g。并且通过动物试验验证出在雏鸡的基础日粮中按照一定比例添加微生态制剂，可以提高肉仔鸡的生长性能。