心肌细胞中微小核糖核酸 let-7c对肌营养素基因表达的调控作用

王玉瑶，王玉璇，翟翔，刘铭，解军

心肌细胞中微小核糖核酸 let-7c对肌营养素基因表达的调控作用

王玉瑶，王玉璇，翟翔，刘铭，解军

目的：探讨心肌细胞中微小核糖核酸（miR）let-7c（miR-let-7c）对肌营养素基因表达是否具有调控作用以及可能的作用机制。

微小核糖核酸；肌营养素；核转录因子-κB

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:1215.)

微小核糖核酸（miR）通过降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译来调控基因表达[1]。最近研究发现miR-let-7家族在心脏组织中高表达，参与许多重要的心脏功能调控[2]，miR-let-7c可能在心肌肥厚中发挥重要作用，但其具体作用靶标和机制仍不清楚[3]。肌营养素（myotrophin, MTPN）是从原发性高血压大鼠的心脏中分离得到的低分子量蛋白，经研究证实肌营养素参与心脏肥厚的起始环节，并在心脏肥厚向心力衰竭的发展过程中发挥重要作用[4-7]。生物信息学分析表明，肌营养素mRNA 的3'非编码区（3'-UTR）可能受miR-let-7c调控，但尚少有切实实验证据的支持。我们拟构建携带有肌营养素mRNA 3'-UTR的重组质粒载体，与miR-let-7c前体共同转入Hela细胞，采用双荧光素酶报告系统分析miR-let-7c对肌营养素表达的调控作用。进一步通过转染大鼠心肌细胞H9c2，研究miR-let-7c上调后对肌营养素基因在心肌细胞中表达的影响，以及对肥厚关键信号分子核转录因子-κB（NF-κB）活性的调控作用，研究结果有助于阐明miR-let-7c在心肌肥厚中的作用机制。

1 材料和方法

实验材料和试剂：胰蛋白酶购自Sigma公司（美国）；胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司（美国）；miR-let-7c前体及抑制剂、pMIRREPORTTMmiRNA表达报告载体购自Ambion公司（美国）；Taqman 实时定量聚合酶链式反应（PCR）相关试剂购自ABI公司（美国）；肌营养素抗体、NF-κB p65抗体购自Santa Cruz公司（美国）。

构建荧光素酶报告系统：合成含肌营养素3'-UTR关键区域的核酸片段，序列为： 5'-TATTAAGACCAAG TCATGCAATAATTGAATGTACCTCAAATTTTTA-3'， 经PCR，HindⅢ和SpeⅠ双酶切，将上述序列克隆入pMIR-REPORT荧光素酶报告基因表达载体，重组载体经测序验证后命名为重组荧光素酶报告基因表达载体（pMIR-MTPN）。Hela细胞培养在含10% 胎牛血清的DMEM培养液中，转染前1天给细胞换液至无胎牛血清的DMEM培养液中，每孔接种1×105细胞于24孔细胞培养板中，每孔200 ng 重组载体DNA pMIR-MTPN和miR-let-7c前体或者阴性对照（终浓度为50 nmol/L）与Lipofectamine 2000试剂混合后分别对Hela细胞进行共转染，分为3个实验组（n=3）：（1）pMIR-MTPN单纯载体组；（2）pMIR-MTPN +miR前体阴性对照组；（3）pMIRMTPN + miR-let-7c前体组。各组细胞培养48 h后，用磷酸盐（PBS）缓冲液洗涤三遍，加入被动裂解缓冲液（PLB），细胞裂解液检测并计算标准荧光素酶活性（荧光素酶活性检测仪，美国Turner 公司）。

miR转染大鼠H9c2心肌细胞：大鼠H9c2细胞株购自中国科学院细胞库，于含10%胎牛血清DMEM培养液，5% 二氧化碳（CO2），37℃条件下培养。转染实验前，将终浓度为50 nM miR-let-7c前体或抑制剂100 μl DMEM与加入5 μl Lipofectamine 2000试剂100 μl DMEM配成混合液体，H9c2细胞的6孔板中的细胞中加入1.8 ml无血清DMEM培养液后，加入该混合液体，37℃孵育6 h，去掉转染液，换2.5 ml DMEM培养48 h，进行后续实验。实验分为4个组（n=3）：（1）miR阴性对照组；（2）miR-let-7c前体组；（3）抑制物阴性对照组；（4） miR-let-7c抑制物组。

实时定量PCR：提取转染后的H9c2细胞总RNA，每份标保本取10 ng RNA进行逆转录，逆转录产物稀释至30 μl后进行实时定量PCR检测，反应体系：0.75 μl 20×探针，2 μl稀释后逆转录产物，7.5 μl 2×Taqman Universal PCR Master Mix Ⅱ，4.75 μl无核酸酶水。反应条件：95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，40个循环。使用U6作为内参基因。采用2-ΔΔCt方法计算分析各组miR-let-7c mRNA的相对表达量。

蛋白质提取及Western blot：裂解液裂解转染后的H9c2细胞，提取细胞总蛋白或分离提取细胞核蛋白，BCA法[8]测定样品蛋白浓度。等量（50 μg）蛋白经十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙稀酰胺凝胶电泳转印至硝酸纤维素膜，分别加入肌营养素一抗（稀释倍数1：1 000）、NF-κB p65以及β-微管蛋白或β-肌动蛋白内参一抗（稀释倍数1：1 000），于4℃孵育过夜，洗膜后，加辣根过氧化物酶标记二抗（稀释倍数1：5 000），室温孵育2 h。X光片显色。使用ImageJ软件分析各条带与内参条带的吸光度值之比。

统计学方法：所有实验均至少重复三次，结果取平均值，数据表达为均数±标准差，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Student’s t检验，统计学处理使用SPSS 13.0软件进行，P＜0.05为差异有统计学意义（双侧）。

2 结果

2.1miR-let-7c作用于肌营养素mRNA 靶向关系验证

双荧光素酶报告系统实验结果表明（图1），在Hela细胞中，与pMIR-MTPN+miR前体阴性对照组相比，pMIR-MTPN+ miR-let-7c前体组荧光素酶活性显著降低，下降了41%[（59.30±9.90）% vs（98.10±15.10）%，P＜0.05]，表明miR-let-7c能够直接作用于肌营养素mRNA 3'-UTR区域。

图1 荧光素酶活性检测miR-let-7c与肌营养素mRNA 3'-UTR区域相互作用（n=3）

2.2miR-let-7c转染大鼠H9c2心肌细胞效果

采用Taqman实时定量PCR法检测 miR转染效果，结果表明（图2），miR-let-7c前体转染H9c2心肌细胞后，与miR阴性对照组相比，miR-let-7c前体组miR-let-7c表达水平显著升高；而miR-let-7c抑制物转染后，与抑制物阴性对照组相比，miR-let-7c抑制物组miR-let-7c表达水平则显著降低（0.42±0.11） 倍。差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图2 Taqman实时定量PCR法检测miR-let-7c前体及抑制物转染H9c2心肌细胞后miR-let-7c表达水平（n=3）

2.3miR-let-7c对肌营养素蛋白表达具有抑制作用

Western blot法检测miR-let-7c转染H9c2心肌细胞后肌营养素蛋白表达，结果表明（图3），miR-let-7c前体组与miR阴性对照组相比，肌营养素蛋白表达水平显著降低（0.28±0.05 vs 0.90±0.09）；而miR-let-7c抑制物转染H9c2心肌细胞后，miR-let-7c抑制物组与抑制物阴性对照组比较肌营养素蛋白表达水平显著升高（1.14±0.09 vs 0.44±0.09）。差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图3 蛋白免疫印迹法检测miR-let-7c对大鼠心肌细胞中肌营养素蛋白表达水平的影响（n=3）

图4 蛋白免疫印迹法检测miR-let-7c对大鼠心肌细胞核中NF-κB p65蛋白表达的影响（n=3）

2.4miR-let-7c 转染心肌细胞后NF-κB蛋白水平变化

Western blot法检测miR-let-7c转染H9c2心肌细胞后细胞核内NF-κB p65蛋白表达，结果表明（图4），miR-let-7c前体组与miR阴性对照组相比，NF-κB p65蛋白表达水平显著降低（0.25±0.06 vs 0.75±0.07）；而miR-let-7c抑制物组与抑制物阴性对照组比较，NF-κB p65蛋白表达水平显著升高（1.09±0.05 vs 0.71±0.06）。差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

心肌肥厚是影响心血管疾病发病率和病死率的独立危险因素。心肌肥厚过程受到多种因素刺激和多种信号通路调控，寻找参与调控心肌肥厚的关键因子，揭示心肌肥厚的分子机制一直以来都是研究热点[9]。近年来，随着对miR功能研究的不断深入，人们已经明确证实了一些miR参与心肌肥厚的调控通路[10-12]，但仍有许多miR在心肌肥厚中的调控机制尚待揭示。miR-let-7是最早被发现的miR之一，在各物种间高度保守。之前大量研究多关注于miR-let-7在肿瘤抑制方面的作用[1,13]。近年来，一系列研究表明，miR-let-7家族还参与心血管系统分化、发育、疾病等诸多生理病理学过程的调控，其中miR-let-7c可能参与了心肌肥厚过程，但其靶标及具体作用机制目前仍不清楚[2,3]。

miR的5’端第2～7或2～8个核苷酸序列称为“种子序列”，这一区域具有高度的保守性，与之互补的靶序列在不同物种中通常也具有高度的保守性，种子序列对于miR识别特异性的靶序列是必需的[14]。肌营养素是蛋白分子量为12 kD的锚定重复序列蛋白，在哺乳动物的组织中广泛表达[15]。一系列基础及临床实验研究均表明，肌营养素是心肌肥厚和心力衰竭的起始因子[4-7]。我们前期通过文献调研和生物信息学分析，发现肌营养素基因3'-UTR区域存在与miR-let-7c种子序列识别和结合的靶序列，克隆该段序列，并进一步通过分子及细胞生物学实验对miR-let-7c能否调控肌营养素基因表达进行了研究，荧光素酶报告系统实验结果证实了miR-let-7c能够直接作用于肌营养素基因3'-UTR相应序列，从而对肌营养素基因表达产生抑制作用。进一步通过在心肌细胞中过表达miR-let-7c前体，发现miR-let-7c能够降低肌营养素在心肌细胞中的蛋白表达水平，从而证实了肌营养素是miR-let-7c在心肌肥厚过程中的调控靶蛋白之一。此外，研究表明，NF-κB信号通路是肌营养素发挥心肌肥厚调控的关键分子通路[5]，NF-κB通路活化时，NF-κB p65转入细胞核内，从而行使一系列调控作用。本研究结果表明，miR-let-7c上调后NF-κB蛋白水平降低，这可能是其参与心肌肥厚的重要分子机制之一。

综上所述，本研究在分子、细胞水平上对miR-let-7c与肌营养素基因3'-UTR位点的相互作用以及肥厚关键分子NF-κB的影响进行了验证，结果表明，miR-let-7c可能通过调节肌营养素基因参与心肌肥厚过程，且该过程涉及NF-κB信号通路，这一结果有助于阐明miR-let-7c在心肌肥厚中的具体分子机制。

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Regulative Effect of microRNA let-7c on Myotrophin Gene Expression in Rat’s H9c2 Cardiac Myocytes

WANG Yu-yao, WANG Yu-xuan, ZHAI Xiang, LIU Ming, XIE Jun.
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan (030001), Shanxi, China

XIE Jun, Email: xiejun1968@126.com

Objective: To explore weather microRNA let-7c (miR-let-7c) could regulate myotrophin gene expression in rat’s H9c2 cardiac myocytes with possible mechanisms.Methods: Recombinant plasmid carrying 3′ untranslated region (3′-UTR) of myotrophin and miRNA precursor of let-7c was co-transfected into Hela cells to construct the luciferase reporter system in order to measure luciferase activity. Rat’s H9c2 cardiac myocytes were cultured. The let-7c gene expression was detected by Taqman probe-based real-time PCR after let-7c miRNA precursor or let-7c miRNA inhibitor transfection respectively; protein expressions of myotrophin and nuclear factorκB (NF-κB) were examined by Western blot analysis.Results: Luciferase activity examination indicated that compared with recombinant luciferase gene expression carrier (pMIR-MTPN)+miR precursor negative control group, pMIR-MTPN+miR-let-7c miRNA precursor group showed reduced luciferase activity (59.30±9.90) % vs (98.10±15.10) %. Western blot analysis presented that compared with miR negative control group, miR-let-7c precursor group had decreased protein expressions of myotrophin (0.28±0.05) vs (0.90±0.09) and NF-κB (0.25±0.06) vs (0.75±0.07); in contrast, compared with Negative inhibitor group, miR-let-7c inhibitor group had increased protein expressions of myotrophin (1.14±0.09) vs (0.44±0.09) and NF-κB (1.09±0.05) vs (0.71±0.06), all P＜0.05.Conclusion: miR-let-7c could inhibit myotrophin expression via acting on its 3′-UTR domain and may also infuence NF-κB signaling pathway in rat’s H9c2 cardiac myocytes.

microRNA; Myotrophin; Nuclear factor-κB

2016-06-20）

（编辑；曹洪红）

国家自然科学基金（81500364）；山西省基础研究项目（2015021187）；山西省高等学校科技创新项目（2015149）

030001 山西省太原市，山西医科大学基础医学院 生物化学与分子生物学教研室

王玉瑶 讲师 博士 主要从事心血管疾病相关基因功能研究 Email：wyybio@163.com 通讯作者：解军 Email： xiejun1968@126.com.

R541

A

1000-3614（2016）12-1215-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2016. 12.015

方法：首先构建携带肌营养素基因3'非编码区（3'-UTR）片段的荧光素酶报告基因载体，与miR-let-7c前体共转染Hela细胞，双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性以验证miR-let-7c与肌营养素基因的靶向调控关系。进而培养大鼠心肌细胞H9c2，Taqman实时定量聚合酶链式反应（PCR）法检测miR转染效果，蛋白免疫印迹（Western blot）法检测miR-let-7c及miR-let-7c抑制物转染心肌细胞后肌营养素蛋白表达，以及心肌肥厚相关信号通路分子核转录因子-κB（NF-κB）的活性变化。

结果：荧光素酶活性实验结果表明，与重组荧光素酶报告基因表达载体（pMIR-MTPN）+ miR前体阴性对照组相比，pMIR-MTPN+ miR-let-7c前体组荧光素酶活性显著降低[（59.30±9.90）% vs （ 98.10±15.10）%]。Western blot结果表明，miR-let-7c前体组与miR阴性对照组相比，肌营养素蛋白表达水平显著降低[（0.28±0.05） vs （0.90±0.09）]，此外，NF-κB蛋白水平显著降低[（0.25±0.06） vs （ 0.75±0.07）]；相反，miR-let-7c抑制物组与抑制物阴性对照组相比，肌营养素蛋白表达水平显著升高[（1.14±0.09） vs（0.44±0.09）]，同时，NF-κB蛋白水平也显著升高[（1.09±0.05）vs（0.71±0.06）]，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。

结论：miR-let-7c能够通过作用于3'UTR区域，抑制肌营养素基因表达，并影响心肌肥厚关键信号通路分子NF-κB的活性。