结肠癌中肿瘤相关钙信号转导蛋白-2的表达及其临床意义

赵 鹏，陈俊卯，曹文斌，杨光华，虞向阳，刘春辉，郑 阳

(华北理工大学附属医院普外科，河北唐山 063000)

结肠癌中肿瘤相关钙信号转导蛋白-2的表达及其临床意义

赵 鹏，陈俊卯，曹文斌，杨光华，虞向阳，刘春辉，郑 阳

(华北理工大学附属医院普外科，河北唐山 063000)

目的 检测肿瘤相关钙信号转导蛋白-2(TROP-2)在结肠癌组织及结肠癌细胞中的表达水平，探讨TROP-2与结肠癌进展的相关性及其对临床预后的意义。方法 应用免疫组织化学法检测TROP-2蛋白在结肠癌组织、癌旁组织及正常结肠组织中的表达情况，回顾患者的临床资料，分析TROP-2蛋白表达水平与不同临床病理特征的相关性及其对临床预后的意义。应用蛋白质印迹法检测TROP-2蛋白在新鲜结肠癌组织标本中的表达情况，并应用免疫荧光法观察TROP-2蛋白的定位。结果TROP-2蛋白主要定位于肿瘤细胞的细胞膜，在细胞质、细胞核则少量表达或不表达。结肠癌组织中TROP-2蛋白表达水平高于癌旁组织和正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)；结肠癌组织中TROP-2蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度无相关性(P>0.05)，而与淋巴结转移情况及Dukes分期有明显相关性(P<0.05)；伴淋巴结转移的患者结肠癌组织TROP-2蛋白阳性率高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.05)；随着肿瘤Dukes分期的进展，结肠癌组织中TROP-2表达水平逐渐升高；TROP-2 蛋白的高表达是结肠癌患者不良预后的独立因子。结论 结肠癌中存在TROP-2的高表达，其在结肠癌侵袭和转移过程中可能发挥着重要作用。

结肠肿瘤；肿瘤相关钙信号转导蛋白-2；侵袭；迁移

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来发病率逐年上升，且总体5年生存率仍然较低。肿瘤的侵袭和转移是导致患者死亡的主要原因，目前对于结肠癌侵袭和转移机制的研究成为热点，但确切的机制尚不明确。肿瘤相关钙信号转导蛋白-2(tumor-associated calcium signal transducer-2，TROP-2)是一种跨膜糖蛋白，最早发现于人滋养层细胞[1]，也称为人滋养层细胞表面抗原-2，它主要参与细胞内钙离子水平的调控。近年来发现，TROP-2在多种人类上皮源性肿瘤中存在高表达，而其在正常组织中不表达或低表达，TROP-2被认为是一种肿瘤相关抗原，与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。然而，目前国内外对于结肠癌中TROP-2表达情况的研究较少。本实验采用蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫组织化学法和免疫荧光法检测结肠癌手术切除标本中TROP-2蛋白的表达情况，并结合患者的临床病理资料进行分析，旨在探讨结肠癌中TROP-2的表达与其进展的相关性，并进一步探讨其临床意义，为结肠癌的早期诊断治疗和预后评价提供理论依据和参考指标，为选择结肠癌靶向治疗的新靶点提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 用于Western blotting检测的新鲜结肠癌手术切除组织标本共47份，均取自华北理工大学附属医院术后病理确诊为原发性结肠腺癌的患者，所有患者均具有完整的临床病理资料，术前均未接受放、化疗等辅助治疗。其中，无淋巴结转移20例，有淋巴结转移27例；根据国际Dukes分期标准：A期6例、B期14例、C期20例、D期7例。

用于免疫组织化学及免疫荧光染色的结肠癌组织切片来源于华北理工大学附属医院病理科存档的结肠癌组织蜡块，所选病例共82例，且选取的病例术前均未接受放、化疗等辅助治疗，术后病理诊断均为原发性结肠腺癌。其中，女30例，男52例；年龄35～90岁，平均(61.6±9.8)岁；低分化腺癌25例、高分化腺癌24例、中分化腺癌33例；无淋巴结转移40例，伴有淋巴结转移42例；根据国际Dukes分期标准：A期10例、B期28例、C期26例、D期18例。本组病例中7例失访，75例有完整的随访信息，生存时间为病理确诊到死亡或最后1次随访的时间。

1.2 主要试剂 鼠抗人TROP-2单克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；山羊抗兔荧光二抗(lgG-DyLight 488)、细胞核染料碘化丙啶(PI)购自美国Cell Signaling Technology公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配置试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白浓度测定试剂盒、牛血清清蛋白(BSA)及超敏电化学发光(ECL)试剂盒购自碧云天生物技术研究所。免疫组织化学检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色检测结肠癌组织切片中TROP-2蛋白的表达 免疫组织化学染色步骤采用SP法，以鼠抗人TROP-2抗体为一抗，以自身对照作阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。 由本院病理科两名医师参照文献[2]各自独立完成免疫组织化学结果的判定和评分。肿瘤细胞质及细胞膜中出现棕黄色颗粒记为阳性细胞，在高倍镜下任选5个视野进行观察，根据阳性肿瘤细胞所占百分率记分，无明显阳性染色细胞记为0分，阳性细胞数占1%～10%记为1分，阳性细胞数大于10%～50%记为2分，阳性细胞数大于50%记为3分；染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色记为0分；黄色为弱阳性，记为1分；浅棕色为中等阳性，记为2分；棕褐色为强阳性，记为3分；每份标本TROP-2染色的总分为两项之积：0分为(-)，1～3分为(+)，4～6分为(++)，7～9分为(+++)，总分4分以上记为高表达。

1.3.2 间接免疫荧光法检测结肠癌组织切片中TROP-2的表达及定位 切片常规脱蜡及脱水，滴加3%过氧化氢(H2O2)，抗原修复后加入一抗(鼠抗人TROP-2抗体)和荧光素Alexa Fluor®488标记的荧光二抗，细胞核以PI染色，FV1000激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察并拍片。

1.3.3 Western blotting检测结肠癌组织标本和细胞中TROP-2蛋白的表达 提取组织标本的总蛋白，蛋白质定量后行SDS-PAGE凝胶电泳，每孔上样量为100 μg蛋白，电泳并转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，抗TROP-2一抗4 ℃孵育过夜。Tris缓冲生理盐水吐温(TBST)漂洗3次，二抗室温孵育2 h，增强化学发光法显色。以β-actin为内参。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计数资料以例数或百分率表示，比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验进行生存分析，独立因素分析采用Logistic回归分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学检测结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达 82例结肠癌组织中TROP-2蛋白阳性表达者75例(91.5%)，其中高表达55例(67.1%)，低表达20例(24.4%)；癌旁组织中TROP-2蛋白阳性表达者10例(12.2%)，高表达2例(2.4%)，低表达8例(9.8%)。如图1所示，TROP-2的阳性染色颗粒呈棕色或深棕色颗粒，主要分布在肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中,呈弥散分布，胞核阴性。切缘正常结肠组织中无TROP-2阳性染色颗粒。结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达强度高于癌旁组织和正常组织。结肠癌组织TROP-2的阳性率高于癌旁组织和正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)。随着肿瘤Dukes分期的进展，肿瘤组织中TROP-2的表达强度亦逐渐增强，见图2。

A：正常组织；B癌旁组织；C：癌组织。

图1 结肠癌组织TROP-2蛋白的表达(免疫组织化学法，×200)

2.2 结肠癌组织中TROP-2的表达与各临床病理参数的关系 结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度无相关性(P>0.05)，而与淋巴结转移情况及肿瘤Dukes分期有明显相关性。伴淋巴结转移的患者结肠癌组织TROP-2蛋白阳性率高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.05)；随着肿瘤Dukes分期的进展， TROP-2蛋白阳性率逐渐升高，C+D期患者TROP-2蛋白阳性率高于A+B期者，差异有统计学意义(P<0.05)。结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达与各临床病理参数的关系，见表1。

2.3 CLSM观察结肠癌组织中TROP-2的免疫荧光染色 本实验以双标法分别标记TROP-2蛋白和细胞核，荧光素Alexa Fluor®488(绿色荧光)偶联的山羊抗小鼠二抗，特异性结合一抗鼠抗人TROP-2单克隆抗体，PI标记细胞核(红色荧光)。CLSM下观察荧光，如图3所示，TROP-2呈环形绿色荧光，主要是肿瘤细胞膜表达，细胞核呈红色，TROP-2在细胞质、细胞核则少量表达或不表达。正常结肠组织基本无TROP-2蛋白的绿色荧光表达，提示TROP-2在正常结肠组织中基本无表达。随着Dukes分期的进展，TROP-2的绿色荧光呈逐渐增多的趋势，提示随着肿瘤Dukes分期的进展，TROP-2的表达量逐渐升高。

A：Dukes A期；B：Dukes B期；C：Dukes C期；D：Dukes D期。

图2 不同临床Dukes分期结肠癌组织TROP-2蛋白的表达(免疫组织化学法，×200)

2.4 Western blotting检测结肠癌组织中TROP-2蛋白的表达 如图4所示，正常结肠组织、癌旁组织及结肠癌组织中均有TROP-2蛋白的表达，结肠癌组织中TROP-2蛋白表达水平高于癌旁组织和切缘正常结肠组织，差异有统计学意义(P<0.01)；癌旁组织TROP-2表达水平高于切缘正常结肠组织，但差异无统计学意义(P>0.05)。如图5所示，伴淋巴结转移的结肠癌组织TROP-2表达水平高于无淋巴转移的结肠癌组织，差异有统计学意义(P<0.01)；如图6所示，随着肿瘤Dukes分期的进展，结肠癌组织中TROP-2表达水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 结肠癌中TROP-2的表达与预后的相关性 TROP-2高表达结肠癌患者总体生存时间为(31.65±10.14)个月，低表达患者总体生存时间为(64.42±6.45)个月。如图7所示，TROP-2高表达患者的5年生存率明显低于TROP-2低表达患者(38.2%vs. 63.6%)，差异有统计学意义(χ2=34.520，P=0.005)。单因素生存分析结果显示，TROP-2高表达(RR=6.43，95%CI：2.17～9.62，P<0.001)、淋巴结转移(RR=10.94，95%CI：7.43～12.96，P<0.001)、肿瘤Dukes分期(RR=7.58，95%CI：4.26～10.71，P<0.001)与术后的不良预后相关；多因素回归分析表明，校正性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移等影响因素后，TROP-2蛋白高表达(RR=17.209，95%CI：4.239～69.857，P<0.001)是结肠癌患者不良预后的独立因子。

图3 结肠癌组织与正常结肠组织TROP-2蛋白的表达与定位(CLSM×1 200)

1：结肠癌组织；2：正常结肠组织；3：癌旁组织。

图4 结肠癌组织、癌旁组织及正常结肠组织TROP-2蛋白的表达

1、2：无淋巴转移的结肠癌组织；3、4：伴淋巴结转移的结肠癌组织。

图5 TROP-2蛋白表达与淋巴转移的相关性

图6 不同临床Dukes分期结肠癌组织TROP-2蛋白的表达

图7 TROP-2蛋白表达相关结肠癌患者Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

结肠癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一，尽管治疗方法有了很大的进步，但总体病死率仍然很高。肿瘤的侵袭和转移是导致患者死亡的主要原因之一。统计表明约50%的结肠癌患者虽然接受了有效的治疗，但最终仍死于肿瘤的侵袭与转移。国内外针对结肠癌侵袭和转移机制的研究较多，但其确切的机制仍不完全清楚。

TROP-2是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于TACSTD基因家族，由323个氨基酸所组成，包括信号肽、胞外区、跨膜区和胞质尾区4个部分。最初认为TROP-2主要参与细胞内钙离子水平的调控，能够改变细胞内的钙离子水平[3-4]。近年来发现，多种人类上皮源性肿瘤(如卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等)中均存在TROP-2蛋白的高表达[5-13]，其在正常组织中不表达或低表达，TROP-2也被认为是一种肿瘤相关抗原，目前国内对结肠癌中TROP-2表达情况及其作用的研究较少。

本研究发现，TROP-2蛋白主要定位于结肠癌细胞的细胞膜上，结肠癌组织中TROP-2蛋白表达水平高于癌旁组织和正常结肠组织；结肠癌中TROP-2蛋白表达水平与肿瘤的淋巴结转移、临床Dukes分期有明显相关性，而与患者年龄、性别、肿瘤分化程度无相关性。随着Dukes分期的进展，结肠癌组织中TROP-2表达水平逐渐升高。本研究还发现，TROP-2高表达患者总生存率低于TROP-2低表达患者。

综上所述，TROP-2在结肠癌的进展过程中可能起着重要作用，TROP-2蛋白有望成为结肠癌分子靶向治疗的新靶点，但结肠癌中TROP-2蛋白高表达的具体机制仍有待进一步研究。

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The expression and clinical significance of TROP-2 protein in colon cancer

ZhaoPeng，ChenJunmao，CaoWenbin，YangGuanghua，YuXiangyang，LiuChunhui，ZhengYang

(DepartmentofGeneralSurgery,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To detect the expression of TROP-2 protein in colon cancer tissues and cell line,and to explore the relationship between TROP-2 protein and the prognosis of colon cancer and its clinical significance．Methods Immunohistochemical staining method was used to detect the expression of TROP-2 protein in colon cancer tissues,tumor-adjacent tissues and normal colon tissues.By reviewing the clinical data of patients,the correlation between the expression level of TROP-2 and clinical pathological features and significance of TROP-2 for clinical prognosis we analyzed.The expression of TROP-2 protein in fresh tissue specimens was detected by using Western blotting method.Furthermore,the immunofluorescence staining was applied to observe the localization of TROP-2 protein.Results The TROP-2 protein mainly located on tumor cell membrane,while little or no TROP-2 protein expressed in the cytoplasm and nucleus.The expression level of TROP-2 in colon cancer tissues was significantly higher than that in tumor-adjacent tissues and normal tissues,there was statistically significant difference(P<0.01).No correlation was found between the expression of TROP-2 and sex,age and degree of tumor differentiation(P>0.05),while the expression of TROP-2 was significantly correlated with lymph node metastasis and Dukes stage(P<0.05).The positive rate of TROP-2 protein expression in colon cancer tissues with lymph node metastasis was obviously higher than those without lymphatic metastasis(P<0.05).With the progress of the Dukes stage,the expression level of TROP-2 protein also increased gradually.TROP-2 protein up-regulation maybe identified as an independent predictive factor for poor prognosis.Conclusion Increased expression of TROP-2 is observed in colon cancer tissues.TROP-2 may play an important role in colon cancer metastasis and invasion,and could be used as an independent predictive factor for poor prognosis.

colonic neoplasms；tumor-associated calcium signal transducer-2；invasion；migration

赵鹏(1977-)，副主任医师，博士，主要从事胃肠道肿瘤研究。

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.35.020

R

A

1671-8348(2016)35-4963-04

2016-06-26

2016-10-03)