sifA基因缺失沙门菌增强巨噬细胞炎性体活化研究

宋佩烜，胡桂秋，秦晓霞，雷倩倩，冯世源，戚 帅，李坤瑀，杜崇涛，杨勇军，陈 巍

(吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062)

研究论文

sifA基因缺失沙门菌增强巨噬细胞炎性体活化研究

宋佩烜，胡桂秋，秦晓霞，雷倩倩，冯世源，戚 帅，李坤瑀，杜崇涛，杨勇军*，陈 巍

(吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062)

利用 λRed 重组系统敲除鼠伤寒沙门菌SL1344的sifA基因以获取△sifA沙门菌。无菌分离培养小鼠骨髓来源巨噬细胞，分别用SL1344沙门菌及△sifA沙门菌刺激细胞，Western blot、ELISA及LDH释放检测方法检测IL-1β分泌, caspase-1表达及LDH的释放。结果表明，△sifA沙门菌促进IL-1β分泌、caspase-1表达增强、LDH释放量增多，即△sifA沙门菌增强炎性体活化。

沙门菌；sifA；基因敲除；炎性小体；增强； 巨噬细胞

沙门菌(Salmonella)是流行最为广泛的病原菌之一，严重危害畜禽和人类健康。沙门菌属有2 500多个血清型，依据其宿主谱分为泛嗜性、偏嗜性和专嗜性沙门菌[1]。由于没有合适的伤寒沙门菌易感动物作为研究模型，多以鼠伤寒沙门菌探讨其致病机理[2]。鼠伤寒沙门菌为泛嗜性肠道致病菌，具有广泛宿主谱，能导致各种家畜、家禽、野生动物及人的沙门菌病，对于幼畜或新生儿等免疫缺陷或低下动物和人群甚至能引起死亡[3]。

炎性体是由模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)、胱冬肽酶-1(caspase-1)前体以及凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)组成的多蛋白复合体，募集的caspase-1前体发生多聚化并水解为活化形式，能够通过caspase-1的半胱天冬酶活性酶切IL-1β和IL-18前体。IL-1β和IL-18作为促炎细胞因子介导局部或系统免疫反应，是天然免疫系统抵御病原侵袭的重要组成部分[4-5]。 研究表明，沙门菌能够被NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)家族蛋白的NLRP3和NLRC4识别，激活NLRP3和NLRC4炎性体，诱导IL-1β的分泌，并且NLRP3与NLRC4所识别的沙门菌配体有所不同。由此，我们通过λ-red重组系统构建缺失sifA相关基因的缺失株[6]，并研究sifA蛋白在沙门菌感染机体产生炎性体的免疫过程中的作用，为深入研究sifA相关功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鼠伤寒沙门菌SL1344(Salmonellaentericasubsp.entericaserovar.typhimuriumSL1344)，λ-red重组系统质粒pKD46,pKD3，pCP20等均由本实验室保存。TaqDNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker、凝胶回收试剂盒及细菌质粒提取试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)；anti-caspase-1、anti-IL-1β、anti-rabbit IgG-HRP抗体，购自Santa Cruz公司；mouse IL-1β ELISA试剂盒，购自R&D公司；mouse LDH试剂盒，购自Progema公司。其他常规试剂均为国产或进口分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 sifA基因缺失鼠伤寒沙门菌的构建 用λ-red重组系统构建缺失株，电转pKD46质粒进入SL1344菌株中，用阿拉伯糖刺激后制备SL1344+pKD46 感受态，电转含同源臂与氯霉素抗性的线性PCR产物进入重组菌株，鉴定重组后电转 pCP20质粒到重组菌株SL1344+cm+感受态中，42℃培养消除氯霉素抗性，获得重组鼠伤寒沙门菌△sifA。

1.2.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的分离培养及处理 无菌分离小鼠后肢骨，RPMI1640培养基冲洗内腔，冲洗液于4℃、1 000 r/min离心10 min，沉淀重悬于含200 g/L LCCM+100 mL/L FBS+1/1000 F/S的RPMI1640，接种于90 mm皿中，培养6 d，消化贴壁细胞，接种于6孔培养板中，贴壁过夜。细胞处理：将小鼠BMDM分为4个处理组,即空白对照组(NT)，LPS组(LPS)，LPS+SL1344组(SL1344)，LPS+△sifA组(△sifA)。500 ng/mL LPS预处理4 h，以不同的MOI(1∶20)细菌处理1 h后洗去培养上清而后添加含抗生素培养基，3 h后收集培养上清用于ELISA,或LDH释放试验，并以细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液用于Western blot检测。

表1 PCR扩增引物序列

Table 1 The primer sequences for PCR amplification

引物名称Primername引物序列(5'～3')Primersequence(5'-3')pKD46F5'-TAGCGGATCCTACCTGAC-3'R5'-ATCAGTTCCTGTGGGTCG-3'CM+F5'-ACCGTAACACGCCACATC-3'R5'-ATCCCAATGGCATCGTAA-3'sifAF5'-CCCAAGGAATACGAAA-3'R5'-CAGCAGGATTGAGACATA-3'Linear-for5'-ATGCCGATTACTATAGGGAATGGTTTTTTAAAAAGTGAAATCCTTACCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGC-3'Linear-rev5'-TTATAAAAAACAACATAAACAGCCGCTTTGTTGTTCTGAGCGAACGTGCACTTAACGGCTGACATGGGAA-3'

1.2.3 Western blot检测 取上述各组细胞吸取上清后，剩余细胞中加入适量RIPA裂解液，匀浆提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取相同量蛋白溶于1×SDS，100℃煮沸 5 min，置-20℃保存，备用。取各处理组相同体积的培养上清，加入相同体积的甲醇，再加入1/4体积的氯仿， 4℃、13 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL甲醇，4℃、13 000 r/min 离心10 min，弃上清液，1×SDS 溶解，100℃煮沸5 min，置-20℃保存，备用。

150 g/L SDS-PAGE分离样品；将蛋白转至PVDF膜上，50 g/L脱脂牛奶室温封闭2h，一抗结合 4℃过夜，1×TBST洗4次，二抗室温结合1 h，1×TBST洗4次，每次15 min，ECL发光，暗室压片曝光显影。

1.2.4 ELISA检测 按照mouse IL-1β Duo Set ELISA试剂盒说明书，检测小鼠骨髓来源巨噬细胞处理后培养上清中IL-1β。

1.2.5 LDH的测定 按照CytoTox 96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay LDH试剂盒说明书，检测小鼠骨髓来源巨噬细胞处理后LDH的释放。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，计量资料以平均数±标准差表示，组内比较采用t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 △sifA鼠伤寒沙门菌的鉴定

应用λ-red基因重组系统，敲除SL1344菌株的sifA基因，获得sifA基因缺失鼠伤寒沙门菌。野生型SL1344含有sifA基因，而重组△sifA菌株缺失sifA基因，并且成功敲除重组氯霉素抗性(图1)。

A:1.DNA标准DL 500;2.阴性对照;3.沙门菌SL1344;4.重组pKD46质粒沙门菌;5.含氯霉素抗性sifA缺失沙门菌;6～9.sifA基因缺失沙门菌B:1.DNA标准DL 500;2.阴性对照;3.沙门菌SL1344;4.重组pKD46质粒沙门菌;5.含氯霉素抗性sifA缺失沙门菌;6-9.sifA基因缺失沙门菌A:1.DNA Marker DL 500;2.NC;3.SL1344;4.SL1344+pKD46;5.SL1344 △sifA+Cm;6-9.SL1344 △sifAB：1.DNA Marker DL 500;2.NC;3.SL1344;4.SL1344+pKD46;5.SL1344 △sifA+Cm;6-9.SL1344 △sifA

2.2 △sifA鼠伤寒沙门菌促进IL-1β分泌

为了进一步分析鼠伤寒沙门菌sifA毒力因子在引起宿主免疫反应过程中是否影响IL-1β的分泌，分别用野生型SL1344菌株与△sifA菌株感染LPS预处理4h 的小鼠BMDM细胞(图2)。在相同条件下△sifA菌株刺激IL-1β分泌增多。说明sifA基因缺失能够促进IL-1β的分泌。

Y轴表示每毫升培养液中白细胞介素-1β分泌量；X轴表示处理组

NT.对照组;SL1344.野生型沙门菌处理组;△sifA.sifA基因缺失沙门菌处理组

Y-axis represents interleukin -1β secretion per ml in culture medium; X-axis represents the treatment groups.NT.Control group;SL1344.Wild-typeSalmonellatreatment group,△ sifA.SifA gene deletionSalmonellatreatment group

图2 △sifA增强BMDM的IL-1β的分泌

Fig.2 △sifA induced IL-1β release of mouse BMDM

2.3 △sifA鼠伤寒沙门菌促进caspase-1活化

为了进一步证明IL-1β分泌增多是否与caspase-1的活化增强有关，通过Western blot 检测了caspase-1裂解片段p10的表达(图3)，其中裂解液中的caspase-1的p45片段作为内参。与野生型SL1344菌株相比，△sifA菌株能显著促进caspase-1裂解片段p10的表达。

2.4 △sifA鼠伤寒沙门菌促进LDH的释放

乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞内含酶之一，正常的细胞LDH较难透过细胞膜。而当细胞受到损伤或死亡时，细胞膜通透性会产生变化，胞浆中的LDH会被释放到培养液中。通过检测细胞培养上清液中的LDH的含量可判断细胞受损的程度。我们通过检测不同MOI试验组间细胞培养上清中的LDH释放判断鼠伤寒沙门菌sifA毒力因子是否影响细胞的损伤(图4)。△sifA菌株促进宿主细胞LDH的释放，即△sifA菌株相比野生型SL1344菌株诱导细胞的损伤增强，且在MOI=50时LDH的释放存在极显著差异(P<0.01)。

SN表示培养液，PELL表示细胞裂解液； 1.对照组;2.脂多糖组;3.野生型SL1344组;4.sifA基因缺失沙门菌组

SN represents culture medium,PELL represents cell lysate; 1.Control group;2.LPS group;3.Wild-typeSalmonellaSL1344 group; 4.△sifASalmonellagroup

图3 △sifA促进IL-1β分泌及caspase-1活化

Fig.3 △sifA promotes secretion of IL-1β and activation of caspase-1

Y轴表示乳酸脱氢酶释放量的百分比；X轴表示不同感染复数处理组 10.感染复数为10；50.感染复数为50；100.感染复数为100

Y-axis represents the percentage of release of LDH; X-axis represents different MOI treatment groups 10.MOI= 10；50.MOI=50；100.MOI= 100

图4 △sifA促进小鼠BMDM中LDH的释放

Fig.4 △sifA promotes LDH release from mouse BMDM

3 讨论

鼠伤寒沙门菌是重要的人兽共患病原菌之一，由于鼠伤寒沙门菌具有较强的胞内侵袭性，侵入细胞后存在于独特的囊泡结构SCV(Salmonella-containing vacuole)中，SCV的形成及成熟为沙门菌在宿主细胞中存活及繁殖提供了有利的微环境[7]。研究表明,沙门菌SPI-2 T3SS效应蛋白能影响宿主细胞基因表达，从而维持SCV膜的完整性、限制SCV移行及与溶酶体的融合[8-9]。其中，sifA是沙门菌维持SCV膜完整性的重要SPI-2 T3SS 效应蛋白，sifA突变的沙门菌不能维持SCV膜完整性而侵入细胞质内[10-11]。并且sifA对于细菌的体外稳定性生长并没有明显的影响[12]。我们发现sifA突变的沙门菌在侵入细胞质内后，能够引起caspase-1这一重

要的炎性小体标志蛋白的活化增强，能够显著促进细胞向胞外分泌IL-1β，并且能够显著提高细胞的损伤程度，推断sifA缺失沙门菌能够增强炎性体活化。然而，对于细胞是通过何种模式识别受体(PRR)来识别sifA缺失沙门菌的目前仍不清楚，sifA毒力因子在沙门菌逃逸细胞免疫反应过程中的作用也有待进一步的研究。sifA缺失所引起的炎性体活化增强与其SCV完整性破坏、病原侵入细胞质相关，或者由于sifA缺失引起沙门菌其他毒力因子更易被宿主所识别等问题的解决，将为进一步揭示沙门菌sifA蛋白的作用，为沙门菌病防控和治疗提供理论依据。

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Deletion of SifA Gene ofSalmonellaEnhances Inflammasome Activation in Macrophages

SONG Pei-xuan,HU Gui-qiu,QIN Xiao-xia,LEI Qian-qian,FENG Shi-yuan1，QI Shuai，LI Kun-yu，DU Chong-tao，YANG Yong-jun，CHEN Wei

(CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity，Changchun,Jilin,130062,China)

To investigate the effect of SifA inSalmonella-induced inflammasomes，in this study，we used λ Red recombination system to knockout SifA gene ofSalmonellatyphimuriumSL1344 and obtain △sifA mutant strain.The peritoneal macrophages from mouse bone marrow wereisolated and cultured.Subsequently,cell culture supernatant and cell lysate were collected after LPS combined with different bacterial stain treated cells.Finally,ELISA，Western blot and LDH release assay were used to detect IL-1β secretion，caspase-1 expression and cell death.The results showed that △sifA promotes IL-1β secretion,caspase-1 expression and cell death.Together, these findings demonstrated that △sifA can enhance the activation of inflammasomes.

Salmonella；sifA；gene knockout; inflammasome；enhancement；macrophage

2015-11-13

国家自然科学基金(3A411V246604)

宋佩烜(1990-)，男，吉林长春人，硕士，主要从事兽医微生物及免疫学研究。*通讯作者

S852.612

A

1007-5038(2016)05-0001-04