15种药材脂溶性提取物对青霉孢子的抑制效果

张腾霄，王斌，魏雅冬

（1.绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061；2.绥化学院农业与水利工程学院，黑龙江绥化152061）

15种药材脂溶性提取物对青霉孢子的抑制效果

张腾霄1，王斌1，魏雅冬2

（1.绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061；2.绥化学院农业与水利工程学院，黑龙江绥化152061）

青霉是一类适应环境能力强且分泌多种毒素的真菌，是造成食品霉烂变质及食用菌严重感染的主要微生物之一。以丙酮为提取溶剂分别对小蓟、柴胡、白鲜皮、金银花、黄柏、徐长卿、苦参、大黄、荆芥、黄芪、板蓝根、土荆皮、石榴皮、黄连和大蒜共15种药材中的脂溶性抑菌成分进行振荡浸渍法提取，采用平板涂布法考察了15种中药材提取物对桔青霉（Penicillium citrinum）、黄绿青霉（Penicillium citreoviride）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）的抑制效果，并与山梨酸钾和多菌灵2种常用的防腐杀菌剂做对照比较。结果显示，桔青霉孢子对药物敏感性最低、抵抗力最强，15种药材提取物对青霉孢子的抑制效果存在很大差异，其中，大蒜和徐长卿抑制效果最好，抑制率接近100%，抑菌性能高于山梨酸钾和多菌灵；金银花、柴胡、小蓟和黄柏对3种青霉孢子有明显的抑制效果，抑制率为56.7%～81.8%；黄芪、板蓝根和黄连不仅无抑制效果甚至还能促进其生长；作为阳性对照的山梨酸钾对青霉孢子有明显的抑制作用，但多菌灵对青霉孢子几乎无抑制作用。大蒜和金银花提取物抑制效能受浓度的影响小，抑制效能稳定可靠；徐长卿、柴胡和小蓟提取物随着浓度的降低抑制率大幅度下降，受浓度的影响较大，抑制能力呈典型的浓度依赖型。

青霉；孢子；食用菌；药材；丙酮；提取物

青霉（Penicillium）是半知菌亚门的一种真菌，大多数青霉菌株可产生真菌毒素，如桔青霉（Penicillium citrinum）产生的桔青霉毒素有很强的肾毒性，黄绿青霉（Penicillium citreoviride）产生的黄绿青霉毒素有神经毒性，岛青霉（Penicillium islandicum）产生的黄天精和含氯肽有很强的肝毒性。各种青霉是造成果菜、粮食霉变、食物中毒的主要微生物[1-6]，青霉还是食用菌栽培过程中为害大、传染性极高的一种竞争性丝状霉菌[7-8]，它的特点是产孢子能力强、感染传播快，短时间内导致成批菌袋报废，造成巨大经济损失。据绥化学院食用菌栽培技术研究课题组的杂菌监测与鉴定，东北地区的青霉危害程度高于木霉，主要原因是青霉在8～20℃的低温下菌丝生长快且仍有快速产孢能力。定期对食用菌制种和栽培环境、菌袋表面喷洒抑菌杀菌药剂可有效预防发病。传统的化学药剂防治，如多菌灵、甲基托布津、二氯异氰尿酸钠、富马酸二甲酯等存在不同程度的残留，对食用菌产品的安全性造成隐患。某些植物中的天然化合物成分对致病真菌有抑制作用[9-17]，在倡导食品安全的指导思想下，绥化学院食用菌栽培技术研究课题组开展了从廉价常用的15种中药材中筛选可以抑制霉菌生长的脂溶性成分的研究，为开发安全、无污染、无公害的青霉菌防治药剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验药品小蓟、金银花、柴胡、徐长卿、黄柏、白鲜皮、苦参、大黄、荆芥、黄芪、黄连、板蓝根、土荆皮、石榴皮中药材购买于黑龙江省绥化市泰华大药房；大蒜购于绥化市华辰超市。

60%多菌灵可湿性粉剂（上海升联化工有限公司），山梨酸钾（分析纯，天津市光复精细化工研究所），丙酮（分析纯，天津致远化学试剂有限公司），氯霉素（吉林省博大制药有限公司，片剂，0.125g/片），氯化钠，葡萄糖，琼脂，磷酸二氢钾，硫酸镁，蛋白胨，虎红。

1.1.2 供试菌株桔青霉（Penicillium citrinum）、黄绿青霉（Penicillium citreoviride）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）由绥化学院食品与制药工程学院微生物实验室分离保藏。

1.1.3 试验仪器HPX-9162MBE数显电热培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），SW-CJ-ZF型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司），FA2104电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），HY-6A双层调速多用振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），M293592型索氏提取器（北京中西远大科技有限公司），微量移液器。

1.2 试验方法

1.2.1 药材提取物的制备分别将小蓟、柴胡、白鲜皮、金银花、黄柏、徐长卿、苦参、大黄、荆芥、黄芪、板蓝根、土荆皮、石榴皮、黄连14种药材粉碎成3～5 mm小段或颗粒；大蒜切成1～2 mm厚的薄片后50℃烘干12 h，得大蒜片干品，以利于脂溶性成分的提取；以山梨酸钾（标记为P1）、多菌灵（标记为P2）2种霉菌抑制药设置为2组阳性对照，以生理盐水设置为1组阴性对照（标记为N），对15种中药材按表1的顺序进行编号标记。分别称取15种药材10.0g，药材用双层纱布包裹绳扎后放在250mL的锥形瓶中，加入100 mL的丙酮，锥形瓶封口后放在转速为120 r/min的振荡器上振荡浸提24 h，得到药材的丙酮浸提液，将浸提液装入抽提瓶中，用索氏提取器在65℃下蒸干浸提液中的丙酮，得膏状浸提物，加入5 mL丙酮，振荡并搅拌将吸附在瓶壁上浸提物充分溶解，转移到灭菌试管，得5 mL中药材提取液，试管封口后备用。

表1 中药材及对照物编号

1.2.2 阴性和阳性对照物溶液的制备生理盐水阴性对照液（N，阴性对照）的制备：称取0.90 g氯化钠，溶解于100 mL蒸馏水中，装入三角瓶后，硅胶塞封口双层报纸扎口后，121℃灭菌20 min，得无菌0.9%的生理盐水。

0.5 %山梨酸钾阳性对照液（P1，阳性对照）的制备：称取0.50 g山梨酸钾，溶解于100 mL蒸馏水中，装入三角瓶后，硅胶塞封口双层报纸扎口后，121℃灭菌20 min。

0.5 %多菌灵阳性对照液（P2，阳性对照）的制备：称取0.84 g 60%多菌灵可湿性粉剂，溶解于100 mL蒸馏水中，装入三角瓶后，硅胶塞封口双层报纸扎口后，121℃灭菌20 min。

1.2.3 青霉菌孢子悬液的制备从当地5个食用菌生产基地受霉菌感染的食用菌栽培袋内分离得到桔青霉（Penicillium citrinum）、黄绿青霉（Penicillium citreoviride）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）3种（株）青霉，用PDA培养基试管斜面分别于25℃下纯培养3种青霉，培养72 h斜面上产生一层绿色孢子层，用接种铲刮取少量孢子悬浮于预先灭菌好的100 mL0.9%的生理盐水中，加入氯霉素0.125 g，然后200 r/min振荡2 h后得青霉孢子悬液。青霉孢子悬液中加入氯霉素的目的是杀灭药材提取液及操作过程带进的细菌（因细菌形成菌落后会对结果造成干扰），氯霉素仅杀细菌但不抑制霉菌的生长，高压蒸汽灭菌容易导致中药材提取液中的成分分解或挥发，加入抗生素后不需要再对中药材提取液进行灭菌处理，从而避免了对有效成分的破坏，提高了结果的准确性。

1.2.4 药材提取物对3种青霉孢子生长抑制试验

用直径为9 cm的培养皿制作含虎红染料的PDA培养平板（加入虎红染料的目的是提高培养平板背景颜色，孢子萌发后能形成清晰的菌落），用微量移液器吸取0.5 mL的1.2.1制备的中药材提取液滴于虎红PDA培养平板上，用涂布器反复涂抹，使药液均匀铺展于培养平板，按表1中的标号序列在培养皿上进行标记，每个测试样品做3个平行，取平均值作为统计计算的依据。涂布药液后的培养皿置于真空箱中，真空抽气5 min，使培养平板上的丙酮挥发除去，然后转移到超净工作台内，用微量移液器吸取0.2 mL的青霉孢子悬液滴于上述含药材提出物的虎红PDA培养平板上，用涂布器将孢子悬液在虎红PDA培养基上涂布均匀，设定培养温度为28℃，培养56 h统计结果，记录各个培养皿中的毛状菌落数量，得青霉菌孢子在某一种中药材提取物作用下萌发生长形成的菌落数（cfu），与不含药的阴性对照培养平板比较，并计算抑制率。

抑制率＝（阴性对照平板上菌落数－含中药材提取物的测试平板上菌落数）/阴性对照平板上菌落数×100%。

1.2.5 药材提取物浓度对抑菌效果的影响通过1.2.4筛选出有明显抑菌效果的药材，接着考察提取物浓度与抑菌效率的关系。将1.2.1制备的药材提取液，分别进行1倍、2倍、4倍和6倍稀释，按照1.2.4步骤进行抑菌试验，每组3个平行，记录各个培养皿中的毛状菌落数量，得到青霉在各个药材提取液浓度下菌落数（cfu），与不含药的阴性对照培养平板比较，计算出抑制率，绘制药物提取物浓度与抑制率的关系曲线。

2 结果与分析

2.1 中药材提取物对青霉的抑制效果

表2 药材提取物对桔青霉（Penicillium citrinum）的抑制率%

表3 药材提取物对黄绿青霉（Penicillium citreoviride）的抑制率%

表4 药材提取物对产黄青霉（Penicillium chrysogenum）的抑制率%

在28℃下培养56 h后，15种中药材提取物对桔青霉（Penicillium citrinum）、黄绿青霉（Penicillium citreoviride）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）3种青霉孢子生长抑制结果如表2～4所示。

从表2，3，4可以看出，桔青霉（Penicillium citrinum）、黄绿青霉（Penicillium citreoviride）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）3种青霉孢子对中药提取物的敏感性存在差别，但整体上显现出一致性，体现了青霉种属水平上的生物学共性。15种中药材提取物对桔青霉孢子抑制率均偏低，这说明桔青霉孢子抵抗药物能力最强，而黄绿青霉孢子抑制率均偏高，显示其对各个药物敏感、抵抗力最差。15种中药材提取物对3种青霉孢子的抑制能力表现出显著差异，其中，徐长卿、大蒜提取物的抑制作用最强，对青霉孢子的抑制率接近100%，抑制能力明显强于山梨酸钾和多菌灵；金银花、柴胡、小蓟和黄柏提取物的抑制效果次之，抑制率为56.7%～81.8%，但对青霉孢子均有明显的抑制作用；白鲜皮、土荆皮、大黄等中药材提取物对青霉孢子有弱抑制能力，抑制率仅在15.2%～46.7%，抑制效果不够理想；黄芪、板蓝根、黄连3种药材提取物对青霉孢子完全没有抑制作用甚至还有促进其生长的作用；阳性对照组中，山梨酸钾是常用的食品防腐剂，对青霉的抑制率为90.7%～91.7%，有较好的抑制效果；多菌灵在侧耳属菇类的生料栽培、食用菌栽培场地消毒、防治植物病害中使用频率最高，但多菌灵抑制青霉的能力很差，仅有6.7%～16.7%的抑制率，对于青霉污染严重的栽培场所和感染青霉的栽培袋不应选用多菌灵防治。

2.2 提取物浓度对抑菌效果的影响

根据2.1的结果，选取对青霉孢子有明显抑制作用的大蒜、徐长卿、小蓟、金银花、柴胡5种药材浸提物进一步试验；桔青霉孢子对药物的抵抗力最顽强，选作供试菌株进一步试验。以各个药材的丙酮提取物母液（每1 mL丙酮提取物母液相当于含原药材2.0 g）分别进行1倍、2倍、4倍、6倍稀释得4个浓度梯度溶液，测试药材提取物在4个浓度梯度溶液下提取物浓度与抑菌效率的关系，以药材提取物的浓度作为横坐标，以抑制率为纵坐标形成抑菌效率趋势图（图1）。

由图1可知，随着药材提取物浓度的降低，各个药材提取物对青霉孢子的抑制作用整体呈降低的趋势，其中，大蒜提取物对青霉孢子的抑制率受浓度的影响小，抑制效能稳定可靠；徐长卿在较高浓度下抑制率高达100%，但随着浓度的降低对青霉孢子的抑制率大幅度下降，说明徐长卿提取物的抑制作用受浓度影响较大，抑制能力呈典型的浓度依赖型。金银花提取物随浓度的梯度下降对青霉孢子的抑制率下降幅度小，抑制率呈比较平稳的态势，说明金银花提取物的抑制效果受浓度的影响较小。柴胡和小蓟的提取物随药物浓度的降低抑制率显著下降，抑制率快速下降到50%以下，受浓度的影响较大。

3 结论与讨论

本研究以15种常用的清热解毒类的中药材的丙酮提取物为筛选对象，测试了它们对3种青霉的抑制性能，并与山梨酸钾和多菌灵2种常用的防腐杀菌剂做比较，结果发现，这些药材提取物对3种青霉的抑制效果存在巨大差异，成功筛选出抑菌性能明显强于山梨酸钾、多菌灵的大蒜和徐长卿2种药材，其中，大蒜提取物对青霉孢子抑制率为100%，完全抑制了青霉孢子的萌发和生长，且大蒜提取物对青霉孢子的抑制率受浓度的影响小，表现了高效稳定的抑制效能。杨光等[18]研究了大蒜水提液对青霉的抑制作用并用抑菌圈试验证明了大蒜水提物有明显的抑制青霉的作用，这说明大蒜的脂溶性成分和水溶性成分均表现出高效抑制青霉的能力，非常适合开发成新型抑杀青霉菌的药物。金银花、柴胡、小蓟和黄柏有明显的抑制效果，抑制率为56.7%～81.8%；黄芪、板蓝根和黄连不仅无抑制效果甚至还能促进其生长。作为阳性对照的山梨酸钾仅对青霉孢子抑制效果好，多菌灵对青霉几乎无抑制作用。徐长卿提取物随着浓度的降低对青霉孢子的抑制率大幅度下降，抑制能力呈典型的浓度依赖型；金银花提取物的抑制效果受浓度的影响较小；柴胡和小蓟的提取物随药物浓度的降低抑制率显著下降，受浓度的影响较大。

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Inhibitory Effect of 15 Kinds of Herbal Medicine Lipophilic Extracts onPenicilliumSpore

ZHANGTengxiao1，WANGBin1，WEI Yadong2
（1.College ofFood and Pharmaceutical Engineering，Suihua University，Suihua 152061，China；2.College ofAgricultural and Hydraulic Engineering，Suihua University，Suihua 152061，China）

Penicillium is a kind offungus with excellent adaptation environment ability and secreting a variety of toxins,it is one of the main microorganisms caused serious food spoilage and deterioration of edible fungus infection.Extraction of fat soluble components from 15 kinds of herbal medicine materials by acetone,the 15 kinds of herbal medicine materials were cirsii herba,bupleuri radix,dictamni cortex,lonicerae japonicae flos,phellodendri chinensis cortex,cynanchi paniculati radix et rhizoma,sophorae flavescentis radix, rhei radix et rhizoma,schizonepetae herba,astragali radix,istidis radix,pseudolaricis cortex,granati pericarpium,coptidis rhizoma,allii ativi bulbus.The inhibitory effect of 15 kinds of herbal medicine extracts on Penicillium citrinum,Penicillium citreoviride,Penicillium chrysogenum were investigated by the method of plate coating,comparison of the control of potassium sorbate and carbendazim.The results showed that the inhibitory effect ofthese extracts on 3 kinds of Penicillium spore was different,allii ativi bulbus and cynanchi paniculati radix et rhizoma had the best inhibitory effect,its inhibition rate was close to 100%.Lonicerae japonicae flos,bupleuri radix,cirsii herba,phellodendri chinensis cortex had good effect to Penicillium spore,the inhibition rate was 56.7%-81.8%.Astragali radix,istidis radix and coptidis rhizoma had none inhibitory effect,on the contrary,they could promote the germination and growth.Positive control of potassiumsorbate had good inhibitoryeffect,but carbendazimalmost ineffective to Penicillium spore.For extract ofallii ativi bulbus inhibition and lonicerae japonicae flos inhibition efficiencywas affected bythe concentration weakly,inhibition efficiencywas stable and reliable.Extract of sophorae flavescentis radix,bupleuri radix,cirsii herba,whose inhibition ability was decreased with the decrease of the concentration,and those herbal medicine extract was a typical concentration dependent manner.

Penicillium;spore;edible fungi;herbal medicine;acetone;extract

S482.2

A

1002-2481（2016）09-1351-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.09.30

2016-04-27

绥化市科技计划资助项目（KJZD20130085）

张腾霄（1982-），男，山东兖州人，讲师，硕士，主要从事微生物应用、食用菌繁育技术及发酵技术的教学及研究工作。