NMR结合GC-MS技术分析鱿鱼肝脏油脂及其脂肪酸组成

徐彤砚 董亚飞 杨文鸽 徐大伦 张进杰 楼乔明

NMR结合GC-MS技术分析鱿鱼肝脏油脂及其脂肪酸组成

徐彤砚 董亚飞 杨文鸽 徐大伦 张进杰 楼乔明

（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

利用NMR结合GC-MS技术对鱿鱼肝脏油脂及其脂肪酸组成分析。1H NMR结果表明，鱿鱼肝脏总脂脂肪酸中，多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的含量比约为7∶5，n-3型多不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的35%；13C NMR结果表明，鱿鱼肝脏总脂以甘油三酯（71.87%）为主，其次是游离脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），胆固醇（1.13%）和胆固醇酯（0.73%）含量较低，鱿鱼肝油中的DHA和EPA主要以游离形式存在，分别占DHA总量和EPA总量的61.24%和63.11%；GC-MS结果显示，鱿鱼肝脏总脂脂肪酸主要为C16∶0、C18∶1、C20∶1、EPA和DHA，多不饱和脂肪酸的含量高达38.80%，且EPA和DHA占脂肪酸总量的31.50%，表明鱿鱼肝脏具有较高的营养价值及开发前景。

鱿鱼肝脏 NMR GC-MS 油脂 脂肪酸

鱿鱼属软体动物门（Mollusk），头足纲（Cephalopods），十腕目（Decapoda），又名“枪乌贼”、“柔鱼”，具有生长周期短、繁殖力强等特点，是世界上最具开发潜力的海产品之一。目前我国鱿鱼的年捕获量约为80万t，占据世界鱿鱼捕获量的36%左右，是我国重要的远洋捕捞品种。近年来随着鱿鱼加工产量的日益扩大，加工产生的副产物也逐年递增，这些副产物大部分直接被加工成经济价值较低的鱼粉和饲料，有的甚至直接丢弃，造成环境污染和资源浪费。鱿鱼肝脏是鱿鱼加工的主要副产物，约占鱿鱼总重的15%～20%，鱿鱼肝脏脂质含量高，富含EPA和DHA等多不饱和脂肪酸，具有抗动脉硬化，降血压和降血脂的功效，可以作为多不饱和脂肪酸的重要膳食来源［1-2］。因此，鱿鱼肝脏如能得到进一步精深加工，不仅可以减少资源浪费和环境污染，还能获得良好的经济价值和社会效益。

核磁共振（NMR）是一种新型无损检测技术，具有快速、准确、前处理简单、不破坏样品、重复性高等优点，通过核磁共振技术不仅能判断样品的纯度，还能测定样品中不同组分所占的含量［3］。关于核磁共振技术和气相色谱-质谱（GC-MS）技术分析油脂组分的研究报道很多，如Lech等［4］利用1H谱和13C谱分析了防护林土壤中不同脂质组分的含量，Vidal等［5］利用1H谱分析了养殖鲈鱼和野生鲈鱼的脂质组成差异，Davey等［6］利用1H谱实现了微藻中三酰甘油的快速检测和定量，郭无瑕等［1］和高娟等［2］利用GC-MS技术分析了鱿鱼肝脏脂质的脂肪酸组成。目前，将NMR技术结合GC-MS技术分析油脂组成的研究鲜见报道。因此，本研究采用NMR技术分析鱿鱼肝脏油脂组成，并结合GC-MS技术对鱿鱼肝脏油脂的脂肪酸组成进行分析鉴定，以便进一步了解鱿鱼肝脏油脂的组成，为肝脏油脂品质鉴定及开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鱿鱼肝脏：宁波丰群食品有限公司。

37种脂肪酸甲酯混标：美国Sigma公司；氯仿、甲醇、正己烷、氘代氯仿、氯化钠、无水硫酸钠、浓硫酸等分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

AVANCEⅢ400 MHZ核磁共振谱仪：德国Bruker公司；7890A型气相色谱仪：美国Agilent仪器有限公司；M7-80EI型质谱仪：北京普析通用仪器有限公司；RE-2000B旋转蒸发仪：西安安泰仪器科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 油脂提取

参照Folch法［7］提取，取10 g新鲜鱿鱼肝脏匀浆，加70 mL甲醇，振荡30 min后加140 mL氯仿，浸提24 h后过滤，滤液中加40 mL 0.9%的氯化钠溶液，振荡静置分层后，分离下层氯仿层，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，得到鱿鱼肝脏总脂。

1.2.2 核磁共振

取总脂20 mg，加0.6 mL氘代氯仿，转移至核磁管中用于核磁共振分析，以四甲基硅烷（TMS）为内标，采用标准的一维氢谱脉冲程序和氢去耦的碳谱脉冲程序分别采集氢谱和碳谱。采集氢谱的参数为：探针温度298 k，波谱频率400.23 MHz，采点数12 082，谱峰宽度8 223.68 Hz；采集碳谱的参数为：探针温度298 k，波谱频率100.64 MHz，采点数32 768，谱峰宽度24 038.46 Hz。

1.2.3 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg油脂，加入1 mL 5%的浓硫酸-甲醇溶液，于70℃水浴加热1 h，冷却后加1 mL正己烷，静置分层，取上层清液经无水硫酸钠干燥后用于GC-MS分析。

气相色谱条件：DB-WAX毛细管柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm），进样量1 μL，不分流模式，进样口温度250℃，检测器温度250℃，柱流量为1 mL／min。升温程序为50℃保持1 min，以20℃／min升至200℃，再以3℃／min升至230℃，保持15 min，

最后以3℃／min升至240℃，保持13 min，整个过程用时50 min。

质谱条件：GC-MS接口温度250℃，电离方式为EI，电离能量70 eV，离子源温度250℃，扫描周期2.84 次／s，质量扫描范围m／z50～500 u。

2 结果与分析

2.1 核磁共振谱图分析

2.1.1 氢谱分析

核磁共振谱峰积分和浓度成正比，因此可以根据特征谱峰计算油脂中不同组分所占的含量［8］。如图1所示，化学位移为0.94～0.97 ppm的谱峰为n-3型多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA）的-CH3信号，而0.82～0.89 ppm的谱峰为除n-3 PUFA外所有脂肪酸的-CH3信号，通过比较两者的谱峰积分可得n-3 PUFA与其他脂肪酸的比例，由此可得n-3 PUFA占脂肪酸总量的35%。化学位移为2.25～2.33 ppm和2.34～2.40 ppm的谱峰分别为饱和脂肪酸（SFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的-CH2-COOH信号，由此可得PUFA和SFA的含量比为7∶5。

图1 鱿鱼肝脏总脂氢谱谱峰

2.1.2 碳谱分析

核磁共振氢谱谱峰化学位移分散度低，同核耦合产生裂分影响分辨率，并且不能观察不含氢的碳基团，而采用碳谱能得到更加精细的谱峰，能够提供结构鉴定的重要信息，因此是分析油脂常用的方法［9-11］。试验对鱿鱼肝脏总脂进行了13C NMR分析，并将部分谱峰归属列于表1，总脂碳谱谱图如图2、图3所示。由图2可知，甘油三酯、游离脂肪酸、胆固醇、胆固醇酯和磷脂的特征谱峰化学位移分别为61.99、180～177、71.69、73.67 和61.05 ppm。通过比较特征谱峰的积分得到不同组分的含量，其结果如表2所示，鱿鱼肝脏总脂以三酰甘油（71.87%）为主，其次是游离脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），胆固醇（1.13%）和胆固醇酯（0.73%）含量较低。此外，图3中化学位移为129.41和127.57 ppm的谱峰代表游离型DHA的C4和C5信号，化学位移为129.30 ppm的谱峰代表酯型DHA的C5信号；化学位移为128.94和128.70 ppm的谱峰代表游离型EPA的C5和C6信号，而128.86和128.82 ppm 代表酯型EPA的C5和C6信号。因此可以根据谱峰积分得到酯型DHA和EPA与游离型DHA和EPA分别所占的含量，从而可知游离型DHA占DHA总量的61.24%，游离型EPA占EPA总量的63.11%，说明鱿鱼肝脏油脂中的DHA和EPA主要以游离形式存在。

图2 鱿鱼肝脏总脂13 C NMR全谱峰

图3 鱿鱼肝脏总脂碳谱局部谱峰（132～127 ppm）

表1 鱿鱼肝脏总脂碳谱谱峰归属

表2 鱿鱼肝脏油脂各组分含量及其化学位移

2.2 鱿鱼肝脏脂肪酸组成分析

鱿鱼肝脏总脂经甲酯化处理后，采用GC-MS对其脂肪酸组成进行分析，其总离子流色谱图如图4所示。通过标准品对照和数据库检索对其脂肪酸进行定性，并按峰面积归一化方法进行定量，其结果列于表3。

图4 鱿鱼肝脏总脂脂肪酸组成的GC-MS总离子流色谱图

表3 鱿鱼肝脏总脂脂肪酸组成

如表3所示，从鱿鱼肝脏总脂中共鉴定出25种脂肪酸，主要为C16∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-11、DHA和EPA。其中，多不饱和脂肪酸（PUFA，38.80%）＞单不饱和脂肪酸（MUFA，32.96%）＞饱和脂肪酸（SFA，28.24%），SFA 以C16∶0（18.19%）和C18∶0（4.79%）为主，MUFA 以C18∶1n-9（8.20%）和C20∶1n-11（7.42%）为主。PUFA 与SFA 的含量比为6.9∶5，n-3 PUFA占脂肪酸总量的34%，这与核磁共振氢谱所得结果无显著差异（P＞0.1）。鱿鱼肝脏总脂中n-3 PUFA主要为DHA和EPA，两者总量高达31.50%，高于鳐鱼（28.29%）［16］、墨鱼（30.19%）［17］和鳕鱼（21.60%）［18］。EPA 和DHA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、提高免疫力、抑制炎症和促进婴幼儿大脑发育等生理功效［19］。鱿鱼肝脏总脂中富含EPA和DHA等n-3型多不饱和脂肪酸，表明其具有较高的营养价值和保健功能，可以作为EPA和DHA等功能性脂肪酸的重要膳食来源。

3 结论

3.11H NMR结果表明，在鱿鱼肝脏总脂脂肪酸中，多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的含量比约为7∶5，n-3型多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的35%；13C NMR结果表明，肝脏总脂以三酰甘油（71.87%）为主，其次为游离脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），胆固醇（1.13%）和胆固醇酯（0.73%）含量较低；肝油中DHA和EPA主要以游离形式存在，分别占DHA总量和EPA总量的61.24%和63.11%。

3.2 GC-MS结果显示，鱿鱼肝脏总脂脂肪酸以C16∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-11、DHA 和EPA 为主，多不饱和脂肪酸的含量高达38.80%，EPA和DHA占脂肪酸总量的31.50%，表明鱿鱼肝脏油脂具有较高的营养价值和开发前景，可以作为n-3型多不饱和脂肪酸的重要膳食来源。

3.3 利用NMR结合GC-MS技术能更全面地分析油脂组成，为油脂的品质鉴定及加工利用提供理论依据。

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Analysis of Lipids and Fatty Acids Compositions of Squid Liver by NMR and GC-MS

Xu Tongyan Dong Yafei Yang Wenge Xu Dalun Zhang Jinjie Lou Qiaoming
（School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）

NMR spectroscopy，in conjunction with GC-MStechniques，was used to study the compositions of lipids and fatty acids of squid liver oil.The results of 1H NMR indicate that the content ratio of PUFA and SFA was 7∶5 in total fatty acids of squid liver oil，and n-3 PUFA accounts for 35%of the total fatty acids.The 13C NMR demonstrates that the main constituent of total lipids of squid liver was triglycerides（71.87%），followed by free fatty acids（20.98%）and phospholipids （5.29%），the contents of cholesterols （1.13%）and cholesterol esters（0.73%）were low，DHA and EPA mainly exist in free from in squid liver oil，the contents of free DHA and EPA were 61.24%and 63.11%in total DHA and EPA，respectively.The results of GC-MS show that the main fatty acids were C16∶0，C18∶1，C20∶1，EPA and DHA in squid liver oil.PUFA accounts for 38.80%and the total content of EPA and DHA add up to 31.50%，indicating that the lipids of squid liver have high nutritional values and development prospects.

squid liver，NMR，GC-MS，lipids，fatty acids

TS251.9

A

1003-0174（2016）11-0140-05

国家自然科学基金（31201283），“水产”浙江省重中之重学科开放基金（xkzsc1531），宁波市自然科学基金（2012A610136）

2015-04-01

徐彤砚，女，1993年出生，硕士，食品工程

楼乔明，男，1981年出生，博士，讲师，食品科学