姜黄素抑制膀胱癌T24细胞增殖及Hsp90α的表达

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(南华大学附属第二医院泌尿外科，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

姜黄素抑制膀胱癌T24细胞增殖及Hsp90α的表达

龙向阳,许武军,谢皇,刘俊,阳宁,张涛,汪翼,陈仙,罗志刚

(南华大学附属第二医院泌尿外科，湖南 衡阳 421001)

目的探讨姜黄素对膀胱癌T24细胞增殖以及热休克蛋白90α(Hsp90α)表达的影响。方法培养T24细胞株，分别用不同浓度姜黄素(0,5,10,15,20 μmol/L)处理细胞24小时和20 μmol/L姜黄素分别处理细胞不同时间(0,6,12,24,48小时)，采用四唑盐(MTT)比色法，检测T24细胞的生长抑制率，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，检测Hsp90α 基因mRNA的表达，以蛋白免疫印迹法(Western blotting)，检测Hsp90α蛋白质的表达。结果姜黄素处理后的T24细胞代谢MTT能力降低，细胞生长抑制率明显增加；细胞Hsp90α基因mRNA和蛋白质的表达均下调，并且这些效应呈浓度和时间依赖性(P<0.05)。结论姜黄素可能通过调控Hsp90α的表达而抑制T24细胞的增殖。

姜黄素； 膀胱癌； 热休克蛋白90α； 细胞增殖

姜黄是一种中药，姜黄素是从姜黄中提取出来的一种天然成分。研究表明，姜黄素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗炎、利胆等[1]。近年来，姜黄素在抗肿瘤方面的作用越来越引人注意，其抗肿瘤作用已经成为其主要的药理作用之一。越来越多的研究发现姜黄素对膀胱癌有明显的作用，比如，姜黄素可激活人膀胱癌T24细胞自噬，进而诱导其凋亡[2,3]；姜黄素对膀胱癌EJ细胞的生长产生抑制作用等[4]，但是，对于姜黄素在肿瘤细胞中发挥生物学作用靶点及分子机制尚未明确。热休克蛋白α(heat shock protein 90 alpha,HSP90α)是一种非常重要的热休克蛋白，它在多种肿瘤细胞中高表达，可影响肿瘤细胞调亡，进而影响肿瘤的发生发展[5-7]，唐伟，等[6]研究发现Hsp90α在膀胱癌组织中高表达，可作为判断膀胱癌预后的指标之一。因此，本研究以姜黄素处理T24细胞，探讨姜黄素对T24细胞增殖及Hsp90α表达的影响，为临床上应用姜黄素治疗膀胱癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞培养T24细胞生长于RMPI 1640培养基(Gibco公司)中，其中含终浓度为10%的新生牛血清(杭州四季青)，培养基中加有青、链霉素各100 U/mL。细胞培养条件为37 ℃、5% CO2，静置培养，每2～3天更换培养液，以1∶3比例传代。

1.2四唑盐(MTT)比色法检测细胞的生长抑制率

取培养的处于对数生长期的T24细胞，接种至96孔板中，先换无血清培养基培养24 h，再用含有不同浓度姜黄素的培养液培养一定的时间，然后再加入新鲜配制的MTT工作液(Sigma公司分装)培养细胞4 h，通过全自动酶标仪上测定570 nm处的吸光度，经公式计算细胞的生长抑制率。计算公式如下：

1.3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测mRNA的表达采用TRIZOL法常规提取细胞总RNA，经紫外线分光光度仪测定其OD260/OD280的比值，确定所提取总RNA的质量及浓度后，首先按逆转录试剂盒(Promega公司)的说明进行逆转录反应，然后以其转录产物cDNA进行PCR反应。PCR反应程序按说明书(Promega公司)进行，反应体系为25 μL，扩增程序为：95 ℃ 10 min，扩增循环94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共32个循环，然后72 ℃ 510 min延伸。反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶图像分析系统分析各组扩增产物及内参片段灰度值，以二者的比值代表靶分子mRNA表达的变化。

1.4免疫印迹法检测蛋白质的表达常规提取T24细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。蛋白样品加2×蛋白上样缓冲液后煮沸10～15 min使其变性，采用SDS-PAGE垂直电泳(每孔上样量为20 μL，分离胶浓度为10%)，然后电转移至PVDF膜，以5%脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000)摇育过夜，TBST液漂洗后(3次，5 min/次)，室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)2 h，再经TBST液漂洗(3次，5 min/次)，PVDF膜经蛋白质印迹发光检测试剂盒显示于化学发光成像分析系统(Tanon公司)。结果分析以目的蛋白面积灰度值减去背景灰度值以及对照蛋白灰度值的比值进行半定量分析。

2 结 果

2.1不同浓度的姜黄素对T24细胞生长抑制率的影响分别以0,5,10,15,20 μmol/L浓度的姜黄素处理细胞24 h，采用MTT法检测T24细胞的生长抑制率，结果发现，姜黄素处理组细胞代谢MTT的能力显著下降，细胞生长抑制率明显上升，且呈浓度依赖性效应(P<0.05)，结果请见图1。

图1 不同浓度的姜黄素对T24细胞生长抑制率的影响 与0 μmol/L浓度组比较，*：P<0.05

2.2 10 μmol/L的姜黄素处理不同时间后T24细胞生长抑制率的变化以10 μmol/L浓度的姜黄素分别处理细胞0,6,12,24,48 h，然后采用MTT法检测T24细胞的生长抑制率，结果发现，随着姜黄素处理时间的延长，细胞代谢MTT的能力逐渐下降，细胞生长抑制率逐渐增加，效应呈时间依赖性(P<0.05)，结果请见图2。

2.3不同浓度的姜黄素对T24细胞Hsp90α表达的影响分别以0,5,10,15,20 μmol/L浓度的姜黄素处理细胞24 h，分别采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测Hsp90α基因mRNA和蛋白质的表达，结果发现，与对照组比较，姜黄素处理T24细胞后，Hsp90α基因mRNA和蛋白质的表达显著下调，且这种效应呈浓度依赖性(P<0.05)，结果请见图3。

图2 10 μmol/L姜黄素作用不同时间对T24细胞生长抑制率的影响 与对照组(0小时)比较，*：P<0.05

图3 不同浓度的姜黄素对T24细胞Hsp90α表达的影响 与0 μmol/L浓度组比较，*：P<0.05

2.4 10 μmol/L的姜黄素处理不同时间后T24细胞Hsp90α表达的变化以10 μmol/L浓度的姜黄素分别处理细胞0,6,12,24,48小时后，分别采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测Hsp90α基因mRNA和蛋白质的表达，结果发现，随着姜黄素处理T24细胞时间的延长，Hsp90α mRNA和蛋白质的表达逐渐下调，(P<0.05)，结果请见图4。

3 讨 论

近年来，随着我国人口老龄化状况的加剧以及环境因素的影响，膀胱癌的发病率不断增高，目前已经成为我国发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤。目前膀胱癌治疗方面，手术治疗及放疗和化疗均对机体损伤较大，患者生存率偏低，因此，探讨膀胱癌的发病机制及研发治疗膀胱癌的新药物是改善膀胱癌临床治疗效果的根本途径。姜黄素是列为第3代的肿瘤化疗药物之一，属酸性的酚类物质，是从姜黄的根茎中提取的一种天然化合物[2,8]。姜黄素抗肿瘤机制十分复杂，目前众多研究认为它主要的抗癌机制是抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，诱导肿瘤细胞的调亡等[8-10]。本研究应用姜黄素处理T24细胞，结果发现随着姜黄素作用时间的延长和浓度的增加，T24细胞的生长抑制率明显升高，这表明姜黄素可以抑制T24细胞的增殖。

图4 10 μmol/L姜黄素作用不同时间对T24细胞Hsp90α表达的影响 与对照组(0 h)比较，*：P<0.05

热休克蛋白在许多肿瘤中呈高表达，与多种肿瘤的发生、肿瘤细胞的增殖分化和侵袭有关。Hsp90α热休克蛋白家族中重要的一员，它是一种分子伴侣，具有广泛的生物学功能。目前Hsp90α被认为是一种新的肿瘤标志物，与多种肿瘤的发生发展关系密切[11-12]。有研究发现Hsp90α在膀胱癌组织中高表达，Hsp90抑制剂对膀胱癌的发生发展有着重要的作用[13-14]。本研究中观察了姜黄素对T24细胞Hsp90α表达的影响，结果显示，姜黄素处理后，T24细胞中的Hsp90α 基因mRNA和蛋白的表达下调，且其抑制效应呈时间和浓度依赖性。这些结果提示，姜黄素可能是通过抑制Hsp90α的表达而抑制T24细胞的增殖和分化。

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EffectsofCurcuminonInhibitingtheProliferationofBladderCancerT24CellsandHsp90αExpression

LONG Xiangyang,XU Wujun,XIE Huang,et al

(DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin in cell proliferation and expression of heat shock protein 90 alpha (Hsp90α) in bladder cancer cells.MethodsCulture of bladder cancer cell line (T24 cell line),The cells were treated with different concentrations of curcumin (0,5,10,15,20 μmol/L) for 24 hours,or 20 mol/L curcumin were treated with 0,6,12,24,48 h,respectively.Then the growth inhibition rate of T24 cells was detected by the colorimetric assay of four thiazole salt (MTT),the expression of Hsp90 mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR),and the expression of Hsp90 protein was detected by Western blotting.ResultsCompared with the control group,the metabolism ability of T24 cells decreased and the cell growth inhibition rate was increased significantly after the curcumin treatment.At the same time,the expression of Hsp90 mRNA and protein in T24 cells was down regulated,and these effects were concentration and time dependent (P<0.05).ConclusionCurcumin may inhibit the proliferation of bladder cancer cells by regulating the expression of Hsp90.

curcumin; bladder cancer; Hsp90; cell proliferation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.011

2016-03-19；

2016-05-02

R737.14

A

秦旭平)