支气管哮喘患者白三烯受体1基因MicroRNA的表达

刘玉春 林士军 叶建华 阳书坤 张静 陈雄 陈绍山

支气管哮喘患者白三烯受体1基因MicroRNA的表达

刘玉春 林士军 叶建华 阳书坤 张静 陈雄 陈绍山

目的 探讨支气管哮喘患者外周血细胞白三烯受体-1（CysLTR1）基因MicroRNA的表达及临床意义。方法 选择支气管哮喘急性发作患者17例（哮喘发作组）、支气管哮喘诊断明确且临床症状完全缓解3个月以上患者15例（哮喘缓解组）和健康体检者20例（正常对照组），采用RT-PCR技术检测外周血细胞CysLTR1基因MicroRNA的表达，并比较分析3组检测结果。结果CysLTR1基因MicroRNA在正常对照人群和支气管哮喘患者中均有表达，但表达水平不同：哮喘发作组、哮喘缓解组和正常对照组CysLTR1/GAPDH分别为2.4059±0.1983、2.1800±0.2210和1.2300±0.1174，与正常对照组相比，哮喘发作组和哮喘缓解组CysLTR1基因MicroRNA的表达均明显增高（均P＜0.05）；哮喘发作组与哮喘缓解组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 哮喘患者CysLTR1基因MicroRNA高表达可能与哮喘发生或急性发作相关。

支气管哮喘 白三烯受体-1 MicroRNA

支气管哮喘（哮喘）是一种由多种炎性细胞浸润、多种细胞因子参与所致的气道慢性炎症性疾病；临床上突出表现为气道高反应性，特别是气道可逆性阻塞、发作性的呼气性呼吸困难。近年来我国哮喘的发病率和病死率有逐年上升的趋势。因此，有效控制哮喘发作，改善哮喘患者生活质量是一项艰巨的任务。目前哮喘发病机制尚未完全清楚，值得临床工作者深入探究哮喘患者外周血细胞白三烯受体-1（CysLTR1）基因MicroRNA表达，探讨CysLTR1基因与哮喘的关系，以期进一步探索哮喘的发病机制。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2006年9月至2007年12月本院收治的支气管哮喘急性发作患者17例（哮喘发作组），其中男7例，女10例，年龄15～52岁；支气管哮喘诊断明确且临床症状完全缓解3个月以上的患者15例（哮喘缓解组），其中男6例，女9例，年龄14～49岁；同期健康体检者20例，其中男、女各10例，年龄15～50岁（正常对照组）。诊断标准依据中华医学会呼吸分会2002年制定的《支气管哮喘防治指南》[1]。哮喘发作组与哮喘缓解组患者是否用药治疗无限定，但排除患有严重肝、肾、心、脑、血液系统疾病者，以及免疫异常者和肿瘤患者；正常对照组均无其他呼吸系统疾病，无家族过敏史，无鼻炎等过敏性疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 抽取空腹静脉血5ml，提取外周血淋巴细胞。提取步骤严格防控核糖核酸酶（RNase）的污染。

1.2.2 材料与试剂 试剂Human total RNA（美国Zyagen公司，50μg）、Trizol（美国Invitrogen公司，100ml）购于黑龙江广泰医疗科技有限公司；逆转录酶等试剂购于哈尔滨市新弘博实验仪器经销部（中国宝生物工程有限公司100 reactions BK4001）；实验所用引物购于哈尔滨无限峰科技有限公司（中国生工生物工程有限公司），序列如下：CysLTR1上游引物：5-ATGACAGCCATGAGCTTTTTC-3，下游引物：5-CATTCTAAGGACAGAATCAA3_。

1.2.3 检测方法 使用PROMAGE反转录试剂盒进行RT-PCR检测，将扩增终产物进行1%琼脂糖电泳。选用GAPDH作为内参，大小在200bp。使用电泳凝胶定位呈像分析仪（上海天能科技有限公司，型号：Tanon 2500R）对电泳后的凝胶进行不同程度的曝光摄影，采用1D凝胶分析软件对电泳呈像结果进行数据化分析，得到CysLTR1和对照样品的GAPDH量的比值，即CysLTR1/ GAPDH。

1.3 统计学处理 使用SPSS10.0统计软件，计量资料采用表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 内参对照电泳结果 正常对照组与哮喘组（包括急性发作、缓解患者）CysLTR1基因 MicroRNA的GAPDH表现完全一致。出现GAPDH说明检测的细胞数目基本一致，无技术操作错误，反应体系正常，见图1。

图1 对照组与哮喘组CysLTR1基因MicroRNA内参对照电泳图

2.2 正常对照组与哮喘组CysLTR1基因MicroRNA表达 将扩增产物进行1%琼脂糖电泳，1～6电泳道为哮喘组，7～12电泳道为正常对照组，GAPDH条带在200bp，CysLTR1条带位于470bp，见图2。

图2 对照组与哮喘组的CysLTR1基因MicroRNA表达

以GAPDH为内参对照，对待测产物进行半定量分析。CysLTR1基因MicroRNA在正常对照人群、支气管哮喘缓解患者和支气管哮喘急性发作患者中均有表达，但表达水平不同：哮喘发作组、哮喘缓解组和正常对照组 CysLTR1/GAPDH分别为 2.4059±0.1983、2.1800± 0.2210和1.2300±0.1174。与正常对照组相比，哮喘发作组和哮喘缓解组CysLTR1基因MicroRNA表达均明显增高（均P＜0.05）；哮喘发作组与哮喘缓解组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

近年来研究发现人类支气管黏膜的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、B淋巴细胞和浆细胞等炎性细胞CysLTR1基因均有表达[2]，肺的结构细胞平滑肌细胞CysLTR1基因也有明显表达，其他肺结构细胞表达不明显。外周血嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和CD34+前粒细胞均检测到CysLTR1 MicroRNA和蛋白质的表达，且受CysLTs、Th2等多种细胞因子的影响[3-4]。主要表现是CysLTs与靶细胞表面的CysLTR1结合，导致G蛋白下游Gq激活，促使细胞内钙离子浓度升高，引起CysLTR1 MicroRNA和蛋白质表达水平上调，从而产生多种生物学效应[5]。Th2型细胞因子中的IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和IFN-γ等影响不同靶细胞表面的CysLTR1表达增多而产生不同效应。Fujii等[6]比较正常人群与哮喘患者外周血CysLTR1基因MicroRNA表达，发现急性发作哮喘患者的嗜酸性粒细胞CysLTR1表达水平明显高于病情稳定患者，较正常对照者的表达量也明显增高。Amarani等[7]研究发现IFN-γ能上调人气道平滑肌细胞表面CysLTR1表达水平，且该表达水平高低与IFN-γ呈剂量依存关系。说明支气管哮喘患者气道IFN-γ浓度增高，从而作用于气道平滑肌，使细胞表面CysLTR1表达增多，最终导致气道高反应性和支气管哮喘的急性发作。

本次研究结果表明，CysLTR1基因MicroRNA在正常人群、支气管哮喘缓解和急性发作患者中均有所表达，但表达水平不同：哮喘发作组和哮喘缓解组均明显高于正常对照组，而哮喘发作组与哮喘缓解组比较，差异无统计学意义。这与Zhu等[2]研究结果相似。以上说明CysLTR1基因MicroRNA高表达可能与哮喘发生或急性发作相关。研究发现诱导HL60细胞分化成颗粒细胞后，其细胞内LTC4合成酶表达和CysLTs生成增加[8]，细胞膜表面的CysLT1受体表达水平随之增加，对CysLTs的反应明显增强。孟鲁司特是CysLTR1受体选择性拮抗剂，能够抑制嗜酸粒细胞的分化成熟；MK-571也是CysLTR1受体选择性拮抗剂，能抑制17-β-雌三醇诱导原始粒细胞向粒细胞的分化，也能抑制LTD4剂量依赖性诱导粒细胞的终末分化；这说明CysLTs及其受体参与细胞的分化，证明了CysLTR1在哮喘发生、发展中的重要作用。

[1] 中华医学会呼吸病分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南（支气管哮喘的定义、诊断、治疗及教育和管理方案）[J].中华结核和呼吸病杂志, 2003,26(3):132-138.

[2] Zhu J,Qiu YS,Figueroa D J,et al.Localization and upregulation of cysteinylleukotriene-1 receptor in asthmatic bronchialmucosa [J].Am J Respir CellMolBiol,2005,33:531-540.

[3] Early S B,BarekziE,NegriJ,et al.Concordant modulation of cysteinyl leukotriene receptor expression by IL-4 and IFN-gamma on peripheralimmune cells[J].Am J Respir CellMolBiol,2007,36: 715-720.

[4] Gauvreau G M,Plitt J R,Baatjes A,et al.Expression of functional cysteinyl leukotiene receptors by human basophils[J].J Allergy Clin Immunol,2005,116:80-87.

[5] Singh R K,Gupta S,Dastidar S,et al.Cysteinyl leukotrienes and their receptors:molecular and functional characteristics[J].Pharmacology,2010,85:336-349.

[6] Fujii M,Tanaka H,Abe S.Interferon-gamma up-regulates expression ofcysteinylleukotriene type 2 recepters on eosinophils in asthmatic patients[J].Chest,2005,128(5):3148-3155.

[7] AmaraniY,Moore P E,Hoffman R,et al.Interferon-gamma modulates cysteinylleukotriene receptor-1 expression and function in human airway myocytes[J].American Journal of Respiratory and CriticalCare Medicine,2005,164(11):2098-2101.

[8] Zaitsu M,Honjo K,Ishii E,et al.Disodium cromoglycate suppresses the induction of cysteinyl leukotriene synthesis during granulocytic differentiation in HL-60 cells[J].Respir Med 2004,98 (3):235-241.

Expression of cysteinyl leukotrienes receptor 1 MicroRNA in PBMC of patients with asthma

LIU Yuchun,LIN Shijun,YE Jianhua,et al. Department of Respiratory Medicine,Longgang People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518172,China

Objective To investigate the expression ofcysteinylleukotrienes receptor 1(CysLTR1)MicroRNA in peripheral blood mononuclear cell(PBMC)ofpatients with asthma. Methods Seventeen patient with asthma of acute attack,15 patients with remission stage of asthma and 20 healthy individuals were enrolled in the study.CysLTR1 MicroRNA in PBMC was detected by RT-PCR. Results The expression of CysLTR1 MicroRNA was significantly higher in patients with asthma of acute attacks and with remission than in controls(CysLTR1/GAPDH 2.4059±0.1983 and 2.1800±0.2210 vs 1.2300±0.1174,P＜0.05).But there was no significant difference between patients with acute attacks and those with remission (P＞0.05). Conclusion The up-regulated CysLTR1 MicroRNAin PBMC ofasthma patients may be associated with occurrence or acute attack ofthe disease.

Asthma Cysteinylleukotrienes receptor 1 MicroRNA

2015-04-27）

（本文编辑：陈丹）

518172 深圳市龙岗区人民医院呼吸内科

林士军，E-mail：linsj100@126.com