子宫内膜异位症中miR-143、miR-145和miR-126的差异表达

郑冰冰 徐超逸 赵益萍 韩灵芝 虞楼超 段萍

子宫内膜异位症中miR-143、miR-145和miR-126的差异表达

郑冰冰 徐超逸 赵益萍 韩灵芝 虞楼超 段萍

目的 探索子宫内膜异位症（EMs）中miR-143、miR-145和miR-126的差异表达，以及不同月经周期的影响。方法利用real time RT-PCR技术，比较miR-143、miR-145和miR-126在EMs患者在位内膜（EU，2例）、异位内膜（EC，14例）、配对EU+EC（14例），与非EMs患者内膜（EN，28例）中的表达差异；并分析EN和EC组不同月经周期对miR-143、miR-145和miR-126表达的影响。结果 不同月经周期的影响分析，发现仅EN标本中miR-143增生期表达量高于分泌期，差异有统计学意义（P＜0.05）。与EN相比，miR-143和miR-145在EU中均表达上调（P＜0.05），miR-143、miR-145和miR-126在EC中均表达上调（P＜0.01）。配对EU-EC中，miR-143、miR-145和miR-126在EC中均表达上调（P＜0.01）。结论 miR-143、miR-145和miR-126在EMs中表达高于非EMs，在EC中表达高于EU。

子宫内膜异位症 miR-143 miR-145 miR-126

子宫内膜异位症（EMs）是指子宫内膜组织生长在子宫腔被覆内膜和宫体肌层以外部位，是育龄妇女常见疾病之一。EMs的发病机制尚未明确，越来越多研究将在位内膜（EU）和异位内膜（EC）的差异作为重点，包括基因的表达。近年来发现MicroRNA在肿瘤和其他疾病中存在异常表达，其中miR-143、miR-145和miR-126可能在抑癌基因、癌转移、肿瘤侵袭和血管形成中起重要作用。本研究旨在探索miR-143、miR-145和miR-126在EMs与非EMs内膜（EN）中的表达差异，以及不同月经周期对表达量的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本 选取温州医科大学附属第二医院（育英儿童医院）2010年12月至2011年6月EMs患者（均经病理证实）成对的EU和EC标本14例（增生期9例，分泌期4例，增生期－分泌期1例）；EC标本（无配对EU）14例（增生期4例，分泌期10例）；EU标本（无配对EC）2例，均为增生期；非EMs患者（均为子宫肌壁间肌瘤）EN标本28例（增生期13例，分泌期14例，增生期－分泌期1例）。EMs患者均为育龄妇女，EN组、EU组和EC组患者年龄[采用M（P25，P75）表示]为46（43，47）、46（40，48）和39（29，46）岁，均行子宫切除术和（或）卵巢囊肿剥除术，术中或术前3个月均未接受过激素治疗，EC标本取自卵巢巧克力囊肿囊壁。

1.1.2 试剂 Trizol（美国Invitrogen公司）；MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、SYBR Green I Mastermix等（日本Toyobo公司）；引物（上海英骏生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 用Trizol法提取组织总RNA，采用异丙醇沉淀法浓缩RNA，DEPC处理水溶解RNA。紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度，OD260/OD280在1.8～2.2即为合格标本。1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA完整性。

1.2.2 茎环real time RT-PCR验证 根据前期基因芯片结果，挑选表达差异的miR-143、miR-145和miR-126进一步验证。根据已报道的茎环qPCR方法，以内源性对照基因（U6）作为内参，分析MicroRNA表达。miR-143、miR-145、miR-126和U6的相关引物序列见表1。

表1 microRNA茎环real time RT-PCR检测相关引物序列

用日本Toyobo公司提供的逆转录试剂，结合MicroRNA茎环逆转录引物，将RNA逆转录成cDNA，每个逆转录体系中含有1μg的总RNA模板。反应条件：16℃30min，42℃30 min，75℃15min，cDNA稀释1倍后-20℃保存。使用SYBR Green I Mastermix配制PCR反应体系，反应体积为20μl，平行做3个孔。PCR反应条件：95°C 10 min，95°C 15s，60°C 1min，40个循环。使用Roche 480定量PCR仪进行PCR扩增。

1.2.3 计算公式 目的基因表达量用2-ΔCT表示，每个组织标本miR-143、miR-145和miR-126的PCR扩增平均CT值减去U6平均CT值，求出ΔCT值，即目的miRNA的表达相对于内参的变化倍数。EMs中EC标本miR-143、miR-145和miR-126表达的2-ΔC（TREC）除以同一患者EU标本miR-143、miR-145和miR-126表达的2-ΔC（TREU），即2-△△c（tR值），是EC相对于EU中miR-143、miR-145和miR-126的表达倍数变化。R值＞1表示，与配对的EU比较，miR-143、miR-145和miR-126在EC中表达上调；R值＜1表示下调。具体公式如下：△CT=CTMicroRNA-CTU6

△△CT=（CTMicroRNA-CTU6）ectopic-（CTMicroRNA-CTU6）eutopic

REC=2-△CT

REU=2-△CT

R=REC/REU=2-△△CT

1.3 统计学处理 使用SPSS 16.0软件，计量数据呈非正态分布，以M（P25，P75）表示。配对EU-EC差异分析采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验，EN与EC、EU的比较采用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验。

2 结果

2.1 EN和EC标本中miR-143、miR-145和miR-126在不同月经周期的表达差异 EN标本中仅miR-143增生期表达量高于分泌期，差异有统计学意义（Z=-2.041，P＜0.05）。EC标本中，miR-143、miR-145和miR-126在增生期与分泌期的表达差异均无统计学意义（Z=-0.826、-0.097和-1.361，均P＞0.05），见表2。

2.2 EN、EU和EC组中miR-143、miR-145和miR-126的表达差异 miR-143：与EN相比，在EU和EC中表达上调（Z=-1.990和-5.573，均P＜0.05）；与EU相比，在EC中表达上调（Z=-3.515，P＜0.01）。miR-145：与EN相比，在EU和EC中表达上调（Z=-3.027和-5.459，均P＜0.05）；与EU相比，在EC中表达上调（Z=-2.978，P＜0.01）。miR-126：与EN相比，在EC中表达上调（Z=-4.196，P＜0.01）；与EU相比，在EC中表达上调（Z= -3.369，P＜0.01），见表3。

表2 EN和EC标本中miR-143、miR-145和miR-126在增生期和分泌期的表达量

表3 EN、EU和EC组中miR-143、miR-145和miR-126的表达量

2.3 配对EU-EC中miR-143、miR-145和miR-126的表达差异 EC相对于EU的R值＞1，表明与EU相比，miR-143、miR-145和miR-126在EC中表达均上调；经配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验，结果一致（Z=-2.924、-3.113和-2.798，均P＜0.05），见表4。

表4 配对EU-EC中miR-143、miR-145和miR-126的表达量

3 讨论

前期工作将EN、EU和EC标本进行Agilent human MicroRNA寡核苷酸基因芯片分析，筛选出差异表达的MicroRNA（数据未显示）。本研究选择miR-143、miR-145和miR-126进行验证分析。国外研究发现miR-143、miR-145和miR-126在EMs与非EMs中表达量存在差异[1-3]，与本研究结果不完全符合。

相关研究发现miR-143与miR-145表达相似，两者在染色体5q33的定位位置接近，约1.8 kb[4]。Ohlsson等[1]和Filigheddu等[2]研究发现，与配对EU相比，miR-143和miR-145在EC中表达上调。Zhang等[5]在转基因老鼠和肝细胞癌（HCC）患者中，证实转移性HBV-HCC中miR-143表达上调，阻断miR-143表达后，肝脏转移和肺转移被明显抑制。

本研究显示，与EN相比，miR-143和miR-145均在EU和EC中表达上调；与EU相比，miR-143和miR-145均在EC中表达上调。尽管EMs在病理上呈良性表现，但有类似转移性HBV-HCC等恶性肿瘤种植、侵蚀和远处转移能力[6-7]，与上述结果相符。越来越多研究认为“黏附-侵袭-血管形成”是EMs病灶形成过程，血管内皮生长因子与其他促血管生成因子相互作用，促进EMs发生、发展[8]。而miR-126是与血管内皮细胞和血管功能密切相关的MicroRNA。本研究结果显示，与EN相比，miR-126在EC中表达上调；与EU相比，在EC中表达上调；考虑与异位病灶“血管形成”可能存在关联。

近年来，国外对EMs中EU与EC的基因表达差异进行研究，解释了病因假说中异位内膜种植的过程发展[9]。Zhang等[5]发现miR-143抑制FNDC3B的表达，以促进肿瘤细胞扩散和转移；且发现FNDC3B是miR-143直接功能性靶基因。Fan等[10]在高转移潜能的鼠乳腺癌细胞和前列腺癌干细胞中发现，miR-143表达上调后，可抑制FNDC3B表达，从而使肿瘤细胞发生转移。目前尚缺少对miR-143、miR-145和miR-126靶基因的了解。此外，研究发现编码VEGF的非编码区有miR-126的结合位点。Ge等[11]发现miR-126对VEGF表达起负调节作用，部分通过抑制VEGF通路的负调控因子起作用。

miR-143、miR-145和miR-126在EMs中表达高于非EMs，在EC中表达高于EU；miR-143、miR-145和miR-126在EMs的发生、发展过程中起着重要作用。

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Differential expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in endometriosis

ZHENG Bingbing，XU Chaoyi，ZHAO Yiping，et al. Department of Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the differential expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in endometriosis(EMs). Methods The expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 were detected with real-time RT-PCR in eutopic endometrium (EU,n=2),ectopic endometrium(EC,n=14),paired EU+EC(n=14)from women with EMs and normal endometrium(EN,n=28)from women without EMs.The expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 were also detected in different menstrual cycle of EN and/or EC.Results Compared to EN,the expression ofmiR-143,miR-145 in EU was up-regulated(P＜0.05).Compared to EN, the expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in EC was up-regulated(P＜0.01).Compared to corresponding EU samples, the expression of miR-143,miR-145 and miR-126 in EC was up-regulated (P＜0.01).The miR-143 in proliferative endometrium was up-regulated,compared to secretory endometrium in EN group(P＜0.05). Conclusion In endometriosis the expressions of miR-143,miR-145 and miR-126 in ectopic endometrium are up-regulated.

Endometriosis MiR-143 MiR-145 MiR-126

2015-04-13）

（本文编辑：陈丹）

浙江省卫生厅平台重点资助项目（2013RCA035）；温州市科技局课题（Y20100175）

325000 温州医科大学附属第一医院产科（郑冰冰）；温州医科大学附属第二医院妇科（徐超逸、韩灵芝、虞楼超、段萍）；诸暨市人民医院妇产科（赵益萍）

段萍，E-mail：dppddpp@126.com