黄芩苷对惊厥持续状态幼年大鼠海马IL-lβ、NF-κB表达的影响

李云芳 周朱瑛 李光乾

●论 著

黄芩苷对惊厥持续状态幼年大鼠海马IL-lβ、NF-κB表达的影响

李云芳 周朱瑛 李光乾

目的 观察幼年大鼠惊厥持续状态（SC）后海马CA1区神经细胞凋亡以及IL-1β和NF-κB蛋白、MicroRNA表达变化，并了解黄芩苷（BC）对其影响。方法 将195只19 d龄SD雄性大鼠随机分成生理盐水对照组（NS组）、惊厥持续状态组（SC组）和黄芩苷预处理组（BC组），每组65只；各组按处死时间点随机分为4、12、24、48和72 h组。采用氯化锂-匹鲁卡品化学点燃法制备幼年大鼠SC模型；采用免疫组化法检测大鼠海马中IL-lβ、NF-κB蛋白表达，RT-PCR法检测NF-κB MicroRNA表达，TUNEL法检测神经细胞凋亡数。结果 IL-lβ：与NS组（12、24、48和72 h分别为11.47±2.51、12.49±2.58、13.19±2.39和12.79±5.30）比较，SC组（12、24、48和72 h分别为29.38±5.18、40.09±5.16、35.32±6.59和27.98±4.16）表达增强（均P＜0.01）；与SC组比较，BC组（12、24和48 h组分别为21.19±4.54、29.78±4.39和25.91±5.64）表达降低（均P＜0.05）。NF-κB：与NS组（4、12、24、48和72 h组分别为45.76±15.41、41.26±6.28、50.61±12.54、51.72±6.52和52.65±7.65）比较，SC组（4、12、24、48和72 h组分别为64.06±6.18、71.16±6.49、79.34±11.76、67.07±6.58和65.12±9.66）表达增强（均P＜0.05）；与SC组比较，BC组（4、12和24 h组分别为52.65±5.73、56.68±5.37和67.01±9.08）表达降低（均P＜0.05）。NF-κB MicroRNA表达与蛋白表达相似。SC组在惊厥后12 h海马CA1区神经细胞凋亡数为（11.38±2.35）个，高于NS组的（6.19±1.48）个（P＜0.01），48 h达到高峰（28.28±5.17）个；BC组在12、24、48和72 h时神经细胞凋亡数分别为（8.96±2.21）、（13.07±2.47）、（20.51±4.39）和（17.36±4.12）个，均低于SC组（均P＜0.05），但高于NS组（6.19±1.48）、（6.59±1.66）、（6.79±1.15）和（6.31±1.47）个（均P＜0.05）。结论 幼年大鼠SC后海马CA1区IL-1β和NF-κB表达增强，神经细胞凋亡增加；BC预处理能抑制早期IL-1β和NF-κB蛋白、MicroRNA表达，减少神经细胞凋亡，对幼年鼠SC后脑损伤具有一定的保护作用。

海马 惊厥持续状态 惊厥性脑损伤 黄芩苷 白细胞介素-1β NF-κB 凋亡

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of baicalin(BC)pretreatment on expression of interleukin-1β(IL-lβ), nuclear factor-κB(NF-κB)and neuron apoptosis in hippocampal CA1 region in immature rats with status convulsion(SC). Methods One hundred and ninety-five juvenile male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into normal controp group (NS group,n=65),status convulsive group(SC group,n=65)and baicalin pre-treatment group(BC group,n=65).The rats in SC and BC groups were kindled into SC by lithium-pilocarpine chemical method.Expressions of IL-lβ and NF-κB proteins were detected with immunohistochemistry,expression of NF-κB p65 MicroRNA was detected with reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),the neuron apoptosis was observed by TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)method.Results Immunohistochemistry showed that the IOD values of IL-lβ at 12,24,48,72h after SC were 29.38±5.18,40.09±5.16,35.32± 6.59 and 27.98±4.16,respectively in SC group,which were higher than those in NS group(11.47±2.51,12.49±2.58,13.19±2.39 and 12.79±5.30,P＜0.01),the IOD values ofIL-lβ (21.19±4.54,29.78±4.39,25.91±5.64 at 12,24 and 48 h)in BC group were decreased,as compared with those in SC group(P＜0.05).Immunohistochemistry showed that the IOD values of NF-κB(64.06± 6.18,71.16±6.49,79.34±11.76,67.07±6.58 and 65.12±9.66,respectively at 4,12,24,48 and 72h)in SC group were significant higher than those in NS group(45.76±15.41,41.26±6.28,50.61±12.54,51.72±6.52 and 52.65±7.65,respectively,P＜0.05),the IOD values of NF-κB in BC intervention group(52.65±5.73,56.68±5.37 and 67.01±9.08,respectively at 4,12 and 24h)weredecreased as compared with those in SC group(P＜0.05).The expression ofNF-κB mRNAas measured by RT-PCR presented a similar trends as NF-κB protein expression．The number TUNEL positive cells in hippocampus CAl of SC group(11.38±2.35) was higher than that of NS group 12 h after the SC(6.19±1.48,P＜0.01),reached its highest level at 48 h(28.28±5.17).After the intervention with BCTUNELpositive cells showed a significant drop in SC group(8.96±2.21,13.07±2.47,20.51±4.39 and 17.36± 4.12,respectively,12,24,48 and 72 h,P＜0.05),but stillsignificantly higher than those ofNS group(6.19±1.48,6.59±1.66,6.79± 1.15 and 6.31±1.47,respectively,P＜0.05). Conclusion The expression of IL-1β,NF-κB and neuron apoptosis increase in hippocampus ofjuvenile rats with status convulsion,and baicalin can inhibit the expression ofIL-1β and NF-κB in hippocampus and attenuate the neuron apoptosis.

【 Key words】 Hippocampus Status convulsion Convulsion-induced brain injury Baicalin Interleukin-1β NF-κB Apoptosis

惊厥持续状态（SC）可导致脑内选择性的海马神经元坏死、凋亡[1-2]。近年来研究表明免疫系统也参与这一复杂的病理过程[1-2]。IL-1β是参与神经调节的重要细胞因子，具有触发转录因子如NF-κB的能力[3]，进而在不同水平诱导活化Caspase-3，促发神经细胞凋亡，引起脑损伤[4]。黄芩苷（BC）是从中药黄芩中提取的一种黄酮类化合物，实验证明在大鼠脑缺血、缺氧再灌注损伤时具有脑保护作用[5]。本研究建立SC大鼠模型，观察大鼠SC后海马神经细胞凋亡和IL-1β、NF-κB表达的变化，并应用BC进行干预，旨在探讨IL-1β和NF-κB在惊厥性脑损伤中的作用及BC对其表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级19d龄雄性SD大鼠195只，体重60～70g，由中国科学院上海分院试验动物中心提供。先置实验动物中心层流实验室饲养2d，自由摄食、水，室温25℃，相对湿度70%，人工12/12h昼夜循环照明。

1.1.2 主要试剂 匹罗卡品（K80477，美国Sigma公司），氯化锂（K73036，美国Fluka公司），硫酸阿托品针购自浙江瑞新药业股份公司；EDTA抗原修复缓冲液（ZLI-9066）、柠檬酸缓冲液（ZLI-9065）和TUNEL试剂盒（ZK-8005）均由北京中衫金桥生物公司生产；浓缩型DAB试剂盒（L hK612，上海晶美生物工程有限公司生产）。兔抗IL-1β抗体（sc-7884）由Santcruz公司提供，兔抗NF-κB抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；浓缩型SABC-兔IgG试剂盒（L hK612）由上海晶美生物工程有限公司提供。BC注射液（06060721）由河北神威药业有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 采用随机数字表法将实验动物分为生理盐水对照组（NS组）、惊厥持续状态组（SC组）和黄芩苷组（BC组），每组再按时间点随机分为4、12、24、48和72h组各13只。

1.2.2 SC大鼠模型制备 参照李光乾等[2]实验方法制备SC大鼠模型：SC组按127mg/kg剂量腹腔注射氯化锂，18h后按1mg/kg剂量腹腔注射硫酸阿托品以拮抗匹鲁卡品外周胆碱能反应，30min后按100mg/kg剂量腹腔注射匹鲁卡品。观察SC组大鼠出现惊厥发作的行为学表现（主要观察大鼠惊厥潜伏期和惊厥级别）。大鼠惊厥按Racine分级法分为0级（无任何发作迹象）、1级（凝视、咀嚼和须动）、2级（点头、湿狗样抖动或搔抓）、3级（前肢阵挛抽搐）、4级（伴后肢站立的全身强直性发作）和5级（伴有站立并摔倒的全身强直-阵挛性发作）。惊厥发作达4～5级，持续时间达30min以上，惊厥缓解后状态良好的大鼠为合格的SC大鼠模型。当惊厥发作达30min时，给予10%水合氯醛400mg/kg、阿托品1mg/ kg腹腔注射；若惊厥未缓解，可重复给予水合氯醛1～2次，直至惊厥停止。BC组于惊厥前3d予以BC（用生理盐水溶解调节至pH值7.0、浓度0.16%[6]）16mg/kg腹腔注射，每天1次，连续3d，其他处理同SC组。NS组用生理盐水代替氯化锂和匹鲁卡品，其他处理同SC组。

1.2.3 标本采集 水合氯醛400mg/kg麻醉动物，断头处死。迅速剥离颅骨，取出完整脑组织，置于冰盘上，采用高温（180℃）灭RNA酶的刀片和镊子沿矢状裂将脑组织切分；右侧脑组织快速分离出海马，放入去RNA酶的EP管中，迅速置于-80℃液氮中保存。将其左半球在距额极2mm和距尾极1mm处各切一刀，取中间段置于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定24h，脱水、石蜡包埋后，用振荡切片机从视交叉处作冠状连续切片，厚5μm。

1.2.4 海马NF-κB p65 MicroRNA含量检测 采用RT-PCR法。每组随机取8只大鼠的海马，称取50～100mg，采用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，PCR反应用β肌动蛋白（β-actin）作为内参照，NF-κB和β-actin引物由上海基康生物工程有限公司设计合成，序列如下。（1）NF-κB：上游5′-GGCAT－GCGTTTCCGTTACA-3′，下游5′-GATCTGCCGAGTAAACCGGAA-3′，产物长度515 bp；（2）β-actin：上游5′-GGTATGGAATCCTG TGGCAYAT-3′，下游5′-GTCCGCCTAGAAGCAYTT-3′，产物长度345bp。采用RevertAidTM First Strand Cdna Synt hesis Kit和InsTA－clone PCR Cloning Kit（均购自美国Fermentas公司），反应体系为RNase Free d H2O 11.5μl，5×PCR buffer 2.0 μl，10mmol/L dNTP Mixture 0.5μl，25mmol/L MgCl21.2 μl，Taq DNA酶0.2μl，上、下游特异性PCR引物各0.8 μl，cDNA模板3.0μl，在DNA循环合成仪上进行PCR扩增，扩增条件：94℃预变性5min，94℃30 s，57℃30 s，72℃1min，共35个循环，72℃延伸8min。取5μl PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中跑电泳。应用凝胶成像分析系统对条带扫描分析，测定NF-κB p65 PCR产物DNA条带与内参照β-actin条带的吸光度比值作为NF-κB p65 MicroRNA的相对含量。

1.2.5 IL-1β、NF-κB免疫组化染色 每组随机取8只大鼠的石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，加入0.3%H2O2处理10 min，高压修复（IL-1β 5min、NF-κB 10min），加入兔抗IL-1β、NF-κB抗体孵育24h（4℃），生物素化羊抗兔IgG、SABC复合物各孵育10min；步骤间用0.01mol/L PBS充分漂洗。用DAB/H2O2溶液显色5～10min，苏木素复染1min，漂洗，常规脱水，透明，封片。以细胞质中出现棕黄色颗粒细胞为IL-1β阳性细胞，胞核中出现棕黄色颗粒细胞为NF-κB阳性细胞，使用Olympus自动图像采集系统，应用image pro plus5.0软件对各组海马CA1区随机抽取的5个不相重叠的高倍视野测量累积光密度值（IOD）作图像分析。

1.2.6 海马神经凋亡细胞检测 采用TUNEL法。按照试剂盒操作说明书进行：（1）石蜡切片常规脱蜡、水化；（2）用蛋白酶K（20μg/ml）消化孵育，37℃，15min；（3）标记：PBS冲洗3次×5min后，擦干样品周围水分，滴加50 μl TUNEL反应混合物（1∶19），在湿盒中37℃孵育60min；（4）信号转化和分析：PBS冲洗3次×5min后，擦干样品周围水分，加入50μl转化剂POD，在湿盒中37℃孵育30 min；（5）PBS冲洗3次×5min后，加入50μl新鲜配制的DAB底物溶液，室温（20℃）孵育10min，PBS洗5min×3次。自来水冲洗适时中止显色；苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明中性树胶封片；（6）阴性对照：以标记溶液（含有核苷酸混合液的反应液）代替TUNEL反应混合物，其余步骤同上；（7）结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。在光镜下，每张各选CA1区阳性细胞最集中的5个高倍视野，计算出每个高倍视野的阳性细胞数，取其平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，所有数据进行正态性检验，用表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较若满足方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐则用Dunnet′s T3检验；组内不同阶段比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点海马NF-κB p65 MicroRNA表达 NS组大鼠海马NF-κB p65 MicroRNA表达在各时间点差异均无统计学意义（均P＞0.05）；SC组大鼠海马NF-κB p65 MicroRNA表达升高，24h达到峰值，48h开始下降，72h降至基线水平。SC组4、12、24和48h的大鼠海马NF-κB p65 MicroRNA表达均明显高于NS组（均P＜0.05）。BC组4、12和24h的大鼠海马NF-κB p65 MicroRNA表达明显低于SC组（均P＜0.05），见表1和图1（封三）。

表1 各组大鼠不同时间点海马NF-κB p65 MicroRNA表达水平比较

2.2 NF-κB免疫组化结果 NS组各时间点大鼠海马CA1区可见少量NF-κB阳性细胞；SC组大鼠海马CA1区NF-κB阳性细胞在4 h时明显增多，24 h达到峰值。5个时间点SC组海马区NF-κB免疫反应累积IOD值均高于NS组（均P＜0.05）；BC组海马区NF-κB免疫反应累积IOD值均低于SC组，以4、12和24 h时最明显（均P＜0.05）；除4 h外其他4个时间点的IOD值，均为BC组高于NS组（均P＜0.05），见表2和图2（封三）。

表2 各组大鼠不同时间点海马区NF-κB免疫反应累积IOD值比较

2.3 IL-1β免疫组化结果 NS组各时间点大鼠海马CA1区可见少量IL-1β阳性细胞；SC组大鼠海马CA1区IL-1β阳性细胞在12h时明显增多，24h达到峰值，48h开始减少。SC组12、24、48和72h时间点免疫反应累积IOD值均高于NS组（均P＜0.01）；BC组12、24和48h时间点免疫反应累积IOD值均低于SC组（均P＜0.05）；除4h外其他4个时间点的IOD值，均为BC组高于NS组（均P＜0.05），见表3和图3（封三）。

表3 各组大鼠不同时间点海马区IL-lβ免疫反应累积IOD值比较

2.4 各组大鼠海马CA1区TUNEL检测结果 NS组各时间点大鼠海马CA1区均可见少量TUNEL阳性细胞；SC组海马CA1区TUNEL阳性细胞在12h时明显增多，48h达到峰值。SC组12、24、48和72h时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞均多于NS组（均P＜0.01）；BC组12、24和48h时间点TUNEL阳性细胞均少于SC组（均P＜0.05）；除4 h外其他4个时间点的TUNEL阳性细胞数，均为BC组高于NS组（均P＜0.05），见表4和图4（封三）。

表4 各组大鼠不同时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数比较

3 讨论

小儿惊厥易发生SC，且易继发癫痫等后遗症。在惊厥性脑损伤发生过程中，多种因素导致神经元坏死和细胞凋亡是脑损伤的基本原因。有研究报道促炎因子如IL-1β的激活在痫性发生中可能起重要作用[7]。IL-1β主要由脑内的胶质细胞、血脑屏障的内皮细胞、神经元和淋巴细胞通过自分泌和旁分泌途径产生[8]。SC激活损伤区内的炎性细胞，特别是小胶质细胞，分泌关键性细胞因子IL-1β而触发炎症反应[9]，从而导致脑损害。NF-κB最初在B淋巴细胞中检测到，且能与免疫球蛋κ轻链基因增强子上一段10bp核苷酸序列特异性结合的核因子，后来发现其广泛存在于真核细胞内，激活后能进入细胞核内并与DNA结合，从而促进多种靶基因的转录[10]。Gan等[11]研究大鼠氯化锂-匹鲁卡品诱导的颞叶癫痫模型中，IL-1β和NF-κB在癫痫后12h开始升高，3d后下降。Miller等[12]研究发现在惊厥模型中，NF-κB介导了海马神经元的凋亡。研究表明，IL-1β在早期活化后，以IL-1β启动因子特异的方式导致NF-κB持续活化，从而进一步激活其下游信号，产生免疫炎症反应，加重惊厥后脑损伤[13]。

本研究发现，发育期大鼠海马凋亡细胞数在SC后12h明显升高，48h达到峰值，与相关报道相似[14]；提示海马神经元发生病理损害，且以SC后48h改变最明显。同时，大鼠SC后12h海马IL-1β蛋白表达明显增加，24h达到峰值后逐渐下降；而NF-κB于SC后4h开始升高，24h达峰值，72h基本降至正常；且IL-1β与NF-κB表达明显增高开始时间先于大鼠脑组织海马凋亡细胞升高时间，提示IL-1β和NF-κB参与了惊厥后脑损伤的发生、发展过程，这或许是早期惊厥性脑损伤及神经元病理损害的原因之一。本实验表明NF-κB先于IL-1β升高，提示除IL-1β激活NF-κB引起神经元凋亡过程外，SC后可能还存在其他途径激活NF-κB。NF-κB的活化可促使多种炎症介质的释放和激活，并形成一复杂网络，通过相互作用扩大炎症反应，加重脑损伤[15]。一方面，活化后的NF-κB迅速转入细胞核，与数种目的基因特定DNA序列结合，从而启动该基因转录，一些表达产物如ICAM-1、IL-1β等炎症细胞因子参与炎症反应[16]。另一方面，IL-1β释放增加又促进IκB的磷酸化，使NF-κB激活，延续炎症反应的复杂环路调节，导致最初的炎症信号不断放大。有研究表明神经元应激后存在可以激活NF-κB的一系列因子，包括TNF、兴奋性神经递质谷氨酸、神经生长因子、淀粉样前蛋白分泌形式和细胞黏附因子等[17]，但SC后是否存在这些因子对NF-κB的激活，有待进一步研究。

BC是中药黄芩的主要有效成分之一，具有抗炎、降脂、解热、清除超氧阴离子、镇静等作用。最近研究表明BC通过降低缺血再灌注大鼠脑组织MDA含量，并增加SOD活性，抑制自由基导致的脂质过氧化作用，减轻自由基对脑组织的损伤[18]；从而对大鼠脑缺血、缺氧再灌注损伤具有脑保护作用[5-6]。实验研究表明，SC时脑组织会发生缺血缺氧，神经元会产生大量氧自由基，NF-κB的靶基因FasL在氧自由基作用下表达量上调，增强了激活凋亡的灵敏度。本实验发现BC组大鼠海马区IL-1β、NF-κB表达均较SC组明显降低，且海马凋亡神经细胞数明显下降，提示BC对惊厥性脑损伤可能有一定的保护作用。因此，我们推测BC发挥作用的细胞内机制如下：（1）清除惊厥过程中缺血、缺氧造成的细胞内氧自由基；（2）下调IL-1β进而降低NF-κB活性，减少NF-κB调控的一系列细胞因子生成。然而，BC是否通过调节NF-κB抑制蛋白IκB表达，从而阻止NF-κB的核移位及与靶基因DNA的结合，有待进一步实验研究。

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Effects of baicalin pretreatment on expression of IL-lβ,NF-κB and neuron apoptosis in hippocampus of immature rats with status convulsion

LI Yunfang,ZHOU Zhuying，LI Guangqian.Department of Neurology,Hangzhou Children's Hospital，Hangzhou 310014, China

2015-05-18）

（本文编辑：陈丹）

浙江省中医药科技计划项目（2010ZA105）

310014 杭州市儿童医院神经内科

李光乾，E-mail：lgqwz@aliyun.com