去甲斑蝥素对人真皮淋巴管内皮细胞体外三维培养淋巴管生成的影响及其机制

袁小建 李显明 章功年 金东辉 肇恒飞 苏志伟 范跃祖

去甲斑蝥素对人真皮淋巴管内皮细胞体外三维培养淋巴管生成的影响及其机制

袁小建 李显明 章功年 金东辉 肇恒飞 苏志伟 范跃祖

目的 探讨去甲斑蝥素（NCTD）对人真皮淋巴管内皮细胞（HDLEC）体外三维培养淋巴管生成的影响及机制。方法建立HDLEC体外培养淋巴管生成模型，随机分为NCTD组（加1/3 IC50NCTD 40 nM）与空白对照组，作用24 h，观察两组淋巴管生成的形态变化；并采用免疫细胞化学、Western blot试验和qPCR技术测定比较两组淋巴管生成因子（VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3）蛋白和基因表达。结果 NCTD组的HDLEC细胞形态发生改变，很少形成管状结构，时间延长后细胞出现变圆、离壁、浮起、死亡；且NTCD组淋巴管生成（10.9±2.3）个，明显少于空白对照组（68.4±5.2）个（P＜0.01）。免疫细胞化学染色、Western blot试验结果显示，NCTD对HDLEC三维培养淋巴管生成中的VEGF-C和VEGF-D的蛋白表达下调（P＜0.01）。qPCR检测显示，NCTD对VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的基因表达明显降低（P＜0.01）。结论 NCTD对通过下调淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D的蛋白和基因表达，产生抗淋巴管生成的作用。

去甲斑蝥素 人真皮淋巴管内皮细胞 三维培养 抗淋巴管生成

肿瘤细胞通过淋巴管转移是肿瘤扩散的主要途径，但是淋巴管生成过程、作用和机制尚不清楚。去甲斑蝥素（NCTD）是用于治疗癌症的传统中药，其抗淋巴管生成作用的靶点与机制如何，尚待进一步研究。本研究通过人真皮淋巴管内皮细胞（HDLEC）三维培养体外模拟淋巴管生成过程，观察NCTD对淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3蛋白和基因表达的影响，以探讨NCTD抗淋巴管生成的相关分子机制，为肿瘤抗淋巴管生成治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂 HDLEC（美国Sciencell公司），人纤维蛋白原（北京拜德生物有限公司），人凝血酶（美国Sigma公司），NCTD（H20064531，江苏康希制药有限公司），兔抗人VEGF-C抗体（美国invitrogen公司）；兔抗人VEGF-D抗体（美国Abcam公司），兔抗人VEGFR-3抗体（美国Cell Signaling公司），GAPDH（美国Abcam公司），S-P试剂盒、免疫组化试剂盒（上海晶美生物技术有限公司），Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），PCR引物（上海Sangon公司），Real-time PCR试剂盒（大连Takara公司），cDNA逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司），蛋白预染Marker（SM0671，美国Fermentas公司），显影粉、定影粉和X光胶片（上海冠龙公司）。

1.2 纤维蛋白凝胶制备和细胞培养 依据相关文献[1-2]，用PBS溶解人纤维蛋白原（3 mg/ml）和人凝血酶（50 U/ml），在6孔培养板中制备纤维蛋白凝胶，先后加入500 μl纤维蛋白原、100μl内皮细胞培养液和10μl凝血酶溶液凝固，37℃、5%CO2、95%空气饱和湿度培养箱中30min，纤维蛋白原凝胶形成胶冻状。将培养好的HDLEC（第五代细胞）悬液各取300μl注入凝胶表面（细胞浓度1×105ml），静置1h后加入内皮细胞培养液2ml，37℃、5%CO2、95%空气饱和湿度培养箱培养，2d更换培养液1次，每天通过倒置光显微镜观察细胞生长及体外淋巴管生成情况。

HDLEC在体外纤维蛋白凝胶培养1周左右，随机分为空白对照组与NCTD组（加1/3 IC50NCTD 40nM）[2]，继续培养24h，观察形态变化。HDLEC（第五代细胞）培养1周后开始形成淋巴管生成管状结构，随机分为空白对照组与NCTD组（同上），作用24h，应用免疫细胞化学、Western blot试验、qPCR检测HDLEC体外模拟淋巴管生成过程中，NCTD对VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和基因表达的影响。

1.3 qPCR检测 根据Trizol试剂盒指示提取细胞总RNA。通过cDNA逆转录试剂盒合成第一链cDNA，并进行PCR扩增，随后进行定量PCR检测。PCR反应扩展条件：95℃30s，95℃5s，60℃30s，共40个循环。引物为VEGF-C，5′-AGTCGCGACAAACACCTTCT-3′（正义）和5′-GTAGCTCGTGCTGGTGTTCA-3′（反义）；VEGF-D，5′-CAGTGGGTTGATCTGGGACT-3′（正义）和5′-CATGCAGGGTAGGATGGTCT-3′（反义）；VEGFR-3，5′-CGGCTTCAGCTGTAAAGGAC-3′（正义）和5′-GCCTCCAAGGAGTAAGACCC-3′（反义）；GAPDH，5′-GCCTCCAAGGAGTAAGACCC-3′（正义）和5'-TGTGAGGAGGGGAGATTCAG-3′（反义）。使用ABI7900HT序列检测系统（美国Applied Biosystems公司）自带软件分析数据，所有样品一式两份。GAPDH作为每个样本测定的CT值和mRAN相对表达量的内部参照，使用比较循环阈值（2-2-△△CT）方法计算基因表达量。

1.4 Western blot试验 按照试剂盒说明书操作裂解细胞，提取蛋白放置包含有50 mM Tris（pH 7.4）、150mM氯化钠、1%的Trit nX-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠和蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中。参照相关文献[3]将兔抗人VEGF-C和-D和VEGFR-3抗体进行免疫印迹试验。用Odyssey红外成像系统（美国LI-COR Biosciences公司）进行蛋白条带显现，使用Odyssey软件计算相对于GAPDH的荧光强度。运用Image Pro Plus软件确定VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表达的积分光密度（IOD）。

1.5 免疫细胞化学染色 免疫细胞化学染色采用生蛋白链菌素-过氧化物酶（S-P）方法进行。HDLEC接种在浸渍35 mm培养皿纤连蛋白涂覆的玻璃盖玻片上，随机分为空白对照组与NCTD组，作用24h，取出盖玻片，甲醇与丙酮溶液1∶1固定，自然风干后，-20℃冰箱内保存，用S-P法对细胞片进行免疫细胞化学染色，以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。染色结果用Image Pro Plus（美国Media Cybernetics公司）测定IOD。

1.6 统计学处理 使用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 NCTD对HDLEC体外模拟淋巴管生成的影响24h后，可见空白对照组的HDLEC细胞形成圆形或椭圆形、类环状或多环中空管道样“淋巴管生成”雏形结构，见图1；NCTD组HDLEC细胞形态发生改变，很少形成管状结构，时间延长后细胞出现变圆、离壁、浮起、死亡。随机取5个显微镜视野（×200），观察并计算淋巴管生成个数，重复3次取均值，NTCD组淋巴管生成（10.9±2.3）个，明显少于空白对照组（68.4±5.2）个（P＜0.01）。

图1 显微镜下可见（作用24h后，空白对照组可见HDLEC细胞形成多个圆形或椭圆形、类环状或多环中空管道样“淋巴管生成”雏形结构；NCTD组可见HDLEC细胞形成“淋巴管生成”雏形结构的能力减弱，HDLEC细胞聚集浮起，固缩碎裂，凋亡坏死。纤维蛋白凝胶三维培养，相差倒置光学显微镜，×200）

2.2 NCTD对HDLEC在体外模拟淋巴管生成过程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA表达的影响 qPCR结果显示，NCTD能明显降低HDLEC在体外模拟淋巴管生成过程中的VEGF-C（2.41%±0.11%，7.44%±0.11%）、VEGF-D（16.08%±1.12%，27.28%±1.22%）和VEGFR-3（0.95%±0.02%，3.40%±0.02%）的基因表达（P＜0.01）。免疫细胞化学染色结果显示，NCTD能明显降低VEGF-C（0.088±0.011，0.141±0.014）和VEGFD（0.084±0.008，0.138±0.012）的蛋白表达（P＜0.01）；但NCTD组与空白对照组在VEGFR-3（0.130±0.006，0.140± 0.017）的蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。Western blot试验显示，NCTD能明显降低VEGFC（10 183.9±3 382.9，24 892.4±1 540.0）和VEGF-D（10 518.4±3 306.1，27 898.2±1 741.3）的蛋白表达，而两组对VEGFR-3（33579.0±1589.2，39396.9±3 746.3）的蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图2 NCTD对HDLEC体外模拟淋巴管生成过程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的蛋白表达的影响（免疫细胞化学染色）

图3 NCTD对HDLEC外模拟淋巴管生成过程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白表达的影响（Western blot试验）

3 讨论

淋巴管生成对于胚胎期淋巴系统的发育与成体中淋巴管的再生十分重要。一般来说，血管生成总是伴随着淋巴管生成；而肿瘤中存在血管生成，那么可能存在淋巴管生成。2001年首次在动物模型中证实肿瘤淋巴管生成[4-6]。前期研究表明NCTD能明显抑制胆囊和膀胱肿瘤细胞的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白水平和基因水平的表达[7-8]。本研究建立了HDLEC体外三维培养淋巴管生成模型，相差光学显微镜观察到HDLEC在纤维蛋白凝胶三维培养基中形成圆形、椭圆形、类环状或多环中空管道样的“淋巴管生成”雏形结构；而淋巴管状结构的形成与HDLEC增殖、迁移、行走密切相关[2]。本实验应用NTCD后，淋巴管生成个数明显减少，HDLEC形态发生改变，很少形成管状结构，时间延长后HDLEC细胞聚集、浮起，固缩碎裂，淋巴管状结构断裂、破坏，细胞凋亡坏死。这表明NCTD不仅能显著抑制HDLEC三维培养体外模拟形成“淋巴管生成”，而且对已形成的淋巴管状结构有明显的抑制破坏作用。

目前，NCTD已广泛应用于临床抗肿瘤治疗，但迄今尚未见应用于抗肿瘤淋巴管生成方面的报道。本实验通过培养HDLEC建立体外模拟淋巴管生成模型，观察NCTD对HDLEC的直接杀伤和凋亡诱导作用，以及对淋巴管生成因子蛋白和mRNA表达的影响，以研究NCTD抗HDLEC淋巴管生成的作用与机制。通过免疫细胞化学、Western blot试验和qPCR检测发现，NCTD可使HDLEC体外三维培养模拟淋巴管生成过程中的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3在蛋白和mRNA水平表达均明显下调。NCTD的抗HDLEC淋巴管生成作用，可能与其直接抑制淋巴管内皮细胞的增殖、迁移，诱导其凋亡，在蛋白和mRNA水平下调淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表达，阻断VEGFC、VEGF-D和VEGFR-3的信号通道等有关。

前期研究表明，NCTD能有效抑制肿瘤细胞的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表达[7-8]。本实验直接针对淋巴管内皮细胞、HDLEC体外三维培养模拟淋巴管生成和淋巴管生成过程中的VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达进行研究，为NCTD靶向性抗肿瘤淋巴管生成和阻断VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3信号通道提供实验依据与“抗肿瘤淋巴管生成”作用靶点。此外，能否真正抑制恶性肿瘤所诱导的淋巴管生成，有待在荷瘤动物淋巴管生成抑制实验中进一步验证；NCTD与VEGFR-3抗体在抗肿瘤淋巴管生成方面是否协同作用、机制如何，需进一步探讨。

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Inhibitory effect of norcantharidin on human dermal lymphatic endothelial cell in three-dimensional culture

YUAN Xiaojian,LI Xianming，ZHANG Gongnian,et al.Department of Surgery,Jiaxing Maternal and Child Health Hospital,Jiaxing 314000,China

Objective To study the effect of norcantharidin(NCTD)on human dermal lymphatic epithelial cell(HDLEC)in three-dimensional culture and related molecular mechanisms. Methods Three dimensional model of lymphangiogenesis with HDLEC was established to mimic lymphatic capillary-like structures in vitro.The three-dimensional cultured HDLEC were randomly assigned to control group(no NCTD)and NCTD group(cultured with 40 nm NCTD)for 24 h.The morphological changes were observed by inverted microscope,the expressions of VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3 protein and MicroRNA in threedimensional cultured HDLEC were measured by immunohistochemistry,western-blot and qPCR. Results The lymphangiogenesis model in vitro was established successfully by three-dimensional culture of HDLEC.The inhibitory effects of NCTD on lymphangiogenesis in vitro were observed.Compared to control group,the expression of VEGF-C and VEGF-D proteins in NCTD group was significantly down-regulated as showed by immunohistochemistry and Western-blot(P＜0.01),The MicroRNA expression of VEGF-C,VEGF-D and VEGFR-3 in NCTD group was significantly decreased as shown by qPCR(P＜0.01). Conclusion Norcantharidin inhibits lymphangiogenesis by down-regulating the expression of VEGF-C and VEGF-D,suggesting that it might be an effective agent for targeting anti-lymphangiogenesis.

Norcantharidin Lymphatic endothelialcellThree-dimensionalAnti-lymphangiogenesis

2015-02-12）

（本文编辑：陈丹）

314000 嘉兴妇幼保健院外科（袁小建、李显明、章功年、金东辉、肇恒飞、苏志伟，袁小建系同济大学医学院2006级在职研究生）；上海同济大学附属同济医院外科（范跃祖）

袁小建，E-mail：hyyxj2003@163.com