腰椎间盘突出症活血化瘀治疗的目标蛋白筛选及鉴定

关 鹏，尹利军，许建文，韦家鼎，李智斐，邰志洪，桂裕昌，韦玉兰



·论著·

腰椎间盘突出症活血化瘀治疗的目标蛋白筛选及鉴定

关 鹏，尹利军，许建文，韦家鼎，李智斐，邰志洪，桂裕昌，韦玉兰

背景 活血化瘀属于中医药特色疗法，也是临床上非手术治疗腰椎间盘突出症(LIDP)疗效优良的主要方法之一，既往有学者从病理、影像、免疫及基因等角度开展了大量研究，但有关活血化瘀治疗LIDP机制仍未明了。目的 通过同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)结合液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)筛选和鉴定LIDP活血化瘀治疗前后差异表达蛋白，筛选LIDP活血化瘀治疗的目标蛋白。方法 选取2013年7月—2014年12月于广西中医药大学第一附属医院治疗的血瘀证LIDP患者30例为研究对象，予活血化瘀治疗4周，观察患者临床疗效。分别于治疗前后提取患者外周血血清，通过去除高丰度蛋白、测定蛋白浓度、酶解蛋白、肽段iTRAQ标记、高效液相色谱分离、LC-MS/MS分析等程序和方法，筛选及鉴定治疗前后的差异表达蛋白。结合基因本体论注释及KEGG通路分析相关生物信息学，对差异蛋白的功能和代谢通路进行分析。结果 治疗后临床控制19例，显效8例，有效2例，无效1例，总有效率为96.7%(29/30)。iTRAQ联合LC-MS/MS鉴定到300个蛋白质组，其中209个蛋白各通道标记标签均有定量信息，筛选出20个差异表达蛋白，其中呈上调表达及下调表达的差异蛋白各10个。本研究对20个差异蛋白的KEGG富集结果显示，9个差异蛋白富集到27条信号通路。补体和凝血级联反应富集到3个差异蛋白，PPAR信号通路、百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮富集到2个差异蛋白。百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮等11条信号通路富集到补体C3，PI3K-Akt信号通路、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调节等9条信号通路富集到纤维连接蛋白1。结论 活血化瘀治疗血瘀证LIDP效果显著；载脂蛋白A1、载脂蛋白M、载脂蛋白C3、纤维连接蛋白1及补体C3很可能是血瘀证LIDP选用活血化瘀治疗的潜在血清靶蛋白。

椎间盘移位；证型；活血祛瘀剂；蛋白质组学

关鹏，尹利军，许建文，等.腰椎间盘突出症活血化瘀治疗的目标蛋白筛选及鉴定[J].中国全科医学，2016，19(32)：3950-3955.[www.chinagp.net]

GUAN P,YIN L J,XU J W,et al.Screening and identifying the target protein of blood activating and stasis removing for lumbar intervertebral disk protrusion[J].Chinese General Practice，2016，19(32)：3950-3955.

腰椎间盘突出症(LIDP)是骨科常见病，其发病率占脊柱疾病的首位，发病人群以青壮年为主，临床85%以上的患者通过非手术治疗可达临床控制乃至痊愈[1-2]。中医药疗法是其非手术治疗与康复的主要方法之一，但在同一中医辨证标准之下，辨证结果因人而异的情况比较常见，论治的方案既难于统一也影响推广。本文筛选LIDP最常见的中医证型血瘀证患者30例，予活血化瘀治疗，于治疗前后采集患者外周静脉血，采用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)，联合同位素标签和液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)联用技术，筛选和鉴定治疗前后患者血清中的差异表达蛋白，经过生物信息学分析，对活血化瘀治疗LIDP的目标蛋白进行筛选和鉴定，取得较好结果，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 病例纳入与排除标准 纳入标准：(1)根据患者临床症状并结合体征、影像学检查，符合LIDP的诊断标准，且中医辨证为血瘀证[3-7]；(2)年龄19～58岁；(3)自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：(1)合并肝、肾、心脑血管、呼吸系统疾病或精神疾病；(2)合并血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤等；(3)拒绝参与本研究。

1.2 研究对象 选取2013年7月—2014年12月于广西中医药大学第一附属医院治疗的血瘀证LIDP患者30例为研究对象，其中男16例，女14例；平均年龄(41.2±10.9)岁；腰痛并下肢放射性疼痛24例，仅腰臀部疼痛6例；影像学检查示L4/5椎间盘突出11例；L5/S1椎间盘突出14例，两个及以上节段椎间盘突出5例。

1.3 治疗及效果评价

1.3.1 治疗方案 (1)辨证活血化瘀中药煎剂内服，1付/d，早晚分2次口服；(2)活血化瘀外用中药制剂痛区烫疗，2次/d；(3)静脉注射活血化瘀通络中药针剂；(4)循经活血通络推拿手法治疗,1次/d；(5)骨盆电动牵引，牵引质量30～50 kg，30 min/次，1次/d。总疗程4周，治疗期间患者适当卧床休息，坚持腰背肌功能锻炼，对症处理可能出现的并发症，并予健康教育指导，必要时予心理疏导。出院后按健康教育指导方案继续进行适当的功能锻炼、调整生活及饮食习惯。

1.3.2 效果评价 (1)患者一般情况：治疗期间密切观测患者血压、心率及胸闷等情况，有效预防因过度功能锻炼、不适当牵引等引发的异常。(2)腰腿痛程度：于治疗前及治疗后采用视觉模拟评分法(visual analogue scale,VAS)评估腰腿痛程度，由患者记录，或患者提供数据由研究者记录，分数越高，表示疼痛越严重。(3)疗效评价：根据国家中医药管理局批准的行业标准及有关LIDP疗效标准[5-7]，并参照日本骨科学会(JOA)腰椎疾病疗效评判标准委员会制定的腰椎疾患疗效评定基本方案(29分制)给予评价，改善率=〔(治疗后评分-治疗前评分)/(29-治疗前评分)〕×100%。临床控制：改善率≥75%，腰腿痛及相关症状消失，直腿抬高试验阴性，恢复正常工作；显效：改善率50%～<75%，腰腿痛及相关症状基本消失，直腿抬高试验阴性，基本恢复正常工作；有效：改善率25%～<50%，腰腿痛及相关症状减轻，直腿抬高试验可疑阳性，部分恢复工作，但停药后复发；无效：改善率<25%，腰腿痛及相关症状体征无改善，直腿抬高试验阳性，或加重。

1.4 蛋白组学分析[8-11]

1.4.1 主要仪器及试剂 Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan，美国)、AKTA Purifier 100纯化仪(GE Healthcare，美国)、低温高速离心机(Eppendorf5430R，德国)、600V电泳仪(GE Healthcare EPS601，美国)、Agilent 1200液相色谱仪(Agilent，美国)；溴酚蓝(161-0404)购于生工生物工程(上海)股份有限公司，十二烷基硫酸钠(SDS，161-0302)、尿素(Urea，161-0731)、二羟甲基氨基甲烷(Tris，161-0719)、二硫苏糖醇(DTT，161-0404)、吲哚-3-乙酸(IAA，163-2109)均购于美国Bio-Rad公司，碳酸氢铵(NH4HCO3，A6141，美国Sigma公司)。

根据上述结论，给出以下建议：（1）不仅要促进中间品进口贸易，还要继续增加进口中间产品品种类型的多样性，尤其注重从发达国家的进口，提高我国制造业的自主创新意愿并提升企业的创新能力；（2）从高质量进口中间品的技术溢出效应出发，采用不同的政策措施扩大企业创新集约边际，缩小企业的创新成本，进而确保企业创新成功转化率的提升。

1.4.2 采集血样并提取血清蛋白 治疗前后采集清晨空腹外周静脉血2 ml，冰盒取回后4 ℃冰箱静置2～3 h待血液凝固。低温下以3 500 r/min离心10 min(离心半径为9.3 cm)，吸取上清液分装，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 筛选和鉴定目标蛋白 (1)蛋白iTRAQ标记：取等量血清蛋白，经去除高丰度蛋白、Bradford法蛋白浓度测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白酶解和肽段定量等步骤后，取等量混合为内参，并取等量肽段约100 μg，根据AB公司提供的iTRAQ(AB SCIEX)试剂盒说明书要求进行标记，标记试剂114用于标记治疗前，标记试剂115用于标记治疗后，标记试剂116用于标记内参，均重复iTRAQ标记两次。(2)蛋白定量分析和鉴定：采用纳升流速高效液相系统EASY-nLC将样品进行高效液相色谱分离，再经Q-Exactive质谱仪进行质谱分析及鉴定，一级质谱分辨率为70 000(质荷比200)，多肽和多肽碎片质荷比采集方法为每次采集10个碎片图谱(MS2 scan)进行全扫描；二级质谱分辨率为17 500(质荷比200)。质谱分析原始数据为RAW文件，将肽段报告离子峰强度值采用Proteome Discovere 1.4软件进行定量分析，通过Proteome Discovere 1.4将RAW文件提交至Mascot 2.2服务器，结果按误判率≤0.01进行筛选及过滤。

1.4.4 生物信息学分析 依据治疗后/治疗前蛋白比值>1.40或<0.60选取差异蛋白，其中比值>1.40表示表达上调，比值<0.60表示表达下调，分析Gene Ontology数据库中生物信息的分布状况，将蛋白功能用Cluster软件进行注释。对差异蛋白基于KEGG数据库进行通路注释，获取差异蛋白基因参与的所有信号通路，每个信号通路的水平运用Fisher确切概率法进行检验，校正假设检验结果获得误判率，筛选出差异蛋白显著参与的信号通路(P<0.05)。

1.5 质量控制 (1)选取患者均严格按照纳入、排除标准；(2)充分考虑患者年龄、营养状况、药物和治疗等多因素的影响；(3)确保仪器及使用条件的一致性，以避免或降低其对结果所造成的误差，所用试管、离心管、试剂等购自同一厂家，并为同一批商品，并经过相同条件严格消毒；(4)血样从采集到离心、分装的时间均在规定时间内，避免因凝固时间不同而产生的影响，采取低温运送血样，保存过程防止反复冻融；(5)优化高效液相色谱分离以及质谱检测的条件，以确保所产生蛋白质谱的质量；(6)保持操作的一致性，操作过程严格按操作规程进行；(7)统一培训研究人员。

2 结果

2.1 效果评价 治疗期间，无患者失访及脱落，无不良事件发生。治疗前后疼痛VAS分别为(4.8±1.3)、(2.0±1.0)分，差异有统计学意义(t=9.077,P<0.01)；治疗前后JOA评分分别为(13.3±2.6)、(23.4±4.6)分，差异有统计学意义(t=-10.676,P<0.01)；治疗后临床控制19例，显效8例，有效2例，无效1例，总有效率为96.7%(29/30)。

表1 血瘀证LIDP患者治疗后表达上调的蛋白

表2 血瘀证LIDP患者治疗后表达下调的蛋白

2.3 生物信息学分析 本研究对20个差异蛋白进行KEGG富集结果显示，9个差异蛋白富集到27条信号通路。补体及凝血级联反应富集到3个差异蛋白，PPAR信号通路、百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮富集到2个差异蛋白。百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮等11条信号通路富集到补体C3，PI3K-Akt信号通路、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调节等9条信号通路富集到纤维连接蛋白1(见表3)。

3 讨论

LIDP为因创伤、劳损、退变等原因引发椎间盘变性、纤维环完全或部分破裂致髓核膨出、突出乃至游离，压迫或刺激神经根、马尾神经、血管等引起腰痛和/或下肢放射性疼痛、麻木、无力等临床症状的疾病。LIDP是骨科常见病、多发病，通常反复发作、迁延时长，且发病群体日趋年轻化。LIDP常规的治疗方法包括非手术疗法、手术治疗及介于两者之间的经皮穿刺切吸技术等。神经损害持续加重、大小便障碍是手术治疗LIDP的绝对适应证，手术切除突出的椎间盘、扩大神经根管从而解除腰神经根及马尾神经压迫的机制明确。但临床上诊断为LIDP的患者仅10%～20%需行手术治疗[1]。故有学者报道非手术疗法仍为该病目前最基本的治疗方法，且LIDP是自愈性疾病，绝大多数患者可经非手术治疗得到缓解、改善或临床痊愈[12-13]。

LIDP的西医分型通常按突出部位分为侧突型、中央型，或按发生进程分为膨出型、突出型、破裂型、游离型等。祖国传统医学大多按血瘀(气滞)证、寒湿证、肝肾亏虚证、湿热证等辨证施治。文献研究显示，血瘀证LIDP更多见，且其影像学表现与其他证型不同[14-16]。大量临床研究报道，活血化瘀治疗LIDP的疗效确切，但其作用机制未明[17-20]，有待深入研究。本研究显示，血瘀证LIDP患者经活血化瘀治疗后，患者腰腿痛减轻，疼痛VAS较治疗前下降，JOA评分较治疗前升高，总有效率达96.7%，说明本研究中运用活血化瘀治疗血瘀证LIDP是对症的。

表3 治疗前后表达差异蛋白参与的信号通路

蛋白组学可跨越基因组和临床应用之间的鸿沟，通常以1个细胞或组织的基因组所表达全部蛋白为研究内容，这一特点与中医的辨证论治类似，寻求蛋白靶点和中医辨证的目的均是针对临床个性化治疗[21-22]。整体观念、辨证论治是中医学的特点及核心，而辨证论治的核心是证，开展辨证论治与蛋白组学相关研究，则有可能跨越单纯的实体结构或功能模拟研究的局限性，为证实质方面研究开辟新途径，从而实现微观与整体有效对接[23-24]。日本学者利用MALDI-TOF-MS技术对血瘀证LIDP患者的血浆进行蛋白组学分析，结果检测到患者所特有的质谱峰，在采用活血祛瘀方剂桂枝茯苓丸治疗后，随着血瘀的改善，质谱峰也出现变化，提示使用该蛋白芯片系统筛选血瘀及疾病标志物可诊断血瘀[25]。而更新的iTRAQ技术则可同时对4种或8种标本进行相对和绝对定量研究，其重复性好，能够利用同位素标记的方法准确掌握差异蛋白的动态变化，更适用于低丰度蛋白研究[26]。iTRAQ结合LC-MS/MS具有自动化、高敏感、多元化的特点，适用于检测各种酸碱度、离子强度、分子量不同的蛋白，特别适用于不同样本的蛋白的筛选[27]。

本研究应用iTRAQ联合LC-MS/MS筛选经活血化瘀治疗血瘀症LIDP患者的差异蛋白，共筛选到与活血化瘀法治疗血瘀证LIDP相关的差异蛋白209个，选取治疗后与治疗前蛋白比值>1.40或<0.60为显著差异蛋白重点研究，共得到差异蛋白20个，其中上调及下调表达蛋白各10个，涉及转运相关蛋白、免疫调节相关蛋白、细胞生长分化相关蛋白、神经内分泌肿瘤相关蛋白等。载脂蛋白M是血液中主要与高密度脂蛋白结合的一类蛋白，功能上能够促进高密度脂蛋白的生成，如胆固醇逆转运、抗炎以及抗氧化等。载脂蛋白A1是载脂蛋白A族最多的一种组分，也是高密度脂蛋白中的主要载脂蛋白，其能够激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶，并识别高密度脂蛋白受体，在胆固醇的逆向转运中发挥重要作用。载脂蛋白C3为脂蛋白脂酶(LPL)抑制剂，主要经过抑制脂肪酶、肝脂酶的活性来影响脂代谢，在调节脂代谢过程中具有十分重要的作用。载脂蛋白C3与血管内皮细胞受损有关，而血管内皮细胞受损与血瘀证相关。研究显示，载脂蛋白A1在冠心病、糖尿病血瘀证患者血清中表达下调，而载脂蛋白C3在冠心病、糖尿病及高血压等患者血清中均呈高表达，提示冠心病血瘀证相关蛋白主要作用于炎性反应和脂质代谢，脂质代谢紊乱与糖尿病血瘀证相关[28-30]。补体C3是血清中补体水平最高的一种炎性因子，具有调节免疫功能和抗感染的作用。纤维连接蛋白1是一种重要的细胞外基质，参与细胞重建、黏附及迁移过程，还可调动肌动蛋白聚合来调节细胞运动。

本研究对20个差异蛋白的KEGG富集结果显示，9个差异蛋白富集到27条信号通路；差异蛋白涉及的主要信号通路包括转运相关、免疫调节相关、细胞生长分化相关等。补体及凝血级联反应富集到3个差异蛋白，PPAR信号通路、百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮富集到2个差异蛋白。百日咳、美洲锥虫病、金黄色葡萄球菌感染及系统性红斑狼疮等11条信号通路均富集到补体C3，推测补体C3在血瘀证LIDP的发生、发展中发挥重要作用。另外，PI3K-Akt信号通路、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调节等9条信号通路富集到纤维连接蛋白1，提示纤维连接蛋白1在活血化瘀治疗血瘀证LIDP中发挥特殊作用。载脂蛋白M、载脂蛋白A1、载脂蛋白C3均为血瘀证LIDP患者治疗前后的差异表达蛋白，可能是潜在的生物标志物。基于通路富集分析，载脂蛋白A1和载脂蛋白C3进一步被注释到PPAR信号通路中。冯仲锴等[31]研究报道，黄芪甲苷可能通过激活PPAR信号通路促进LIDP髓核细胞的增殖和存活，说明LIDP与PPAR信号通路具有一定相关性，载脂蛋白A1和载脂蛋白C3可能为活血化瘀治疗血瘀证LIDP患者潜在的血清标志物。在本研究中，载脂蛋白M虽未被注释到信号通路中，但本研究发现血瘀证LIDP患者经活血化瘀治疗后载脂蛋白M表达上调。谢沛根等[32]通过双向电泳及对差异蛋白质谱鉴定、酶联免疫吸附实验检测结果显示，载脂蛋白L1、载脂蛋白M、免疫球蛋白轻链及四连接素可作为LIDP的血清生物标志物。所以，笔者推测载脂蛋白M可能也是活血化瘀治疗血瘀证LIDP的潜在血清生物标志物。

综上所述，经生物信息学等综合分析显示，载脂蛋白A1、载脂蛋白M、载脂蛋白C3、纤维连接蛋白1、补体C3可能为活血化瘀治疗血瘀证LIDP潜在的血清标志物。本研究纳入样本量偏少，相关材料与数据主要为同组患者治疗前后自身对照，故有一定的局限性，下一步研究将增加样本量、设立对照组，以进一步验证本研究结论。

作者贡献：关鹏负责资料收集整理、统计学处理、成文；尹利军、韦家鼎、李智斐、邰志洪、桂裕昌、韦玉兰协助课题实施、资料收集整理；许建文进行课题设计与评估、质量控制，并对文章负责。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：吴立波)

Screening and Identifying the Target Protein of Blood Activating and Stasis Removing for Lumbar Intervertebral Disk Protrusion

GUANPeng,YINLi-jun,XUJian-wen,WEIJia-ding,LIZhi-fei,TAIZhi-hong,GUIYu-chang,WEIYu-lan.TheFirstClinicalFacultyofGuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530023,China

XUJian-wen,DepartmentofRehabilitationMedicine，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021,China；E-mail：1049662254@qq.com

Background Promoting blood circulation and removing blood stasis treatment is the characteric therapy used by traditional Chinese medicine,and it′s also one of the main effective non-surgical therapy for lumbar intervertebral disk protrusion (LIDP) in clinic.In the past,scholars had carried out a great deal of researches from the pathology,imaging,immunology and gene about the disease,but the mechanism of LIDP treated by blood circulation was still unknown.Objective To obtain the target protein by screening and identifying the differentially expressed proteins before and after promoting blood circulation and removing blood stasis treatment for LIDP patients,using iTRAQ isobaric tags coupled with LC-MS/MS.Methods 30 LIDP patients diagnosed as blood stasis syndrome by Chinese differentiation clinically from July 2013 to December 2014 in the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine were selected as the experiment subjects.Promoting blood circulation and removing blood stasis treatment were given for 4 weeks and clinical efficacy of patients were observed.The serum of the peripheral blood was extracted before and after the treatment.To screen and identify the differentially expressed proteins before and after the treatment through removing the high abundance protein,measuring the protein concentration,enzymatic hydrolysis of proteins,peptide iTRAQ labeling,high performance liquid chromatography and LC-MS/MS analysis.The functional and metabolic pathways of the differentially expressed proteins were analyzed by the combination of gene ontology annotation and KEGG pathway-related bioinformatics.Results The results showed that 19 cases were clinical controlled,8 cases were excellent,2 cases were effective,1 case was invalid,and the total effective rate of treatment was 96.7%(29/30).In total,300 non-redundant proteins were identified by using the technique of iTRAQ and LC-MS/MS.There were quantitative information on each channel tag in 209 of these proteins.Twenty differentially expressed proteins were screened out,10 upregulated proteins and 10 downregulated proteins.In this study,the KEGG enrichment results of 20 differentially expressed proteins showed that 9 differential proteins were enriched to 27 related signal pathways.The complement and coagulation cascades were enriched to three differential proteins.PPAR signal pathways,pertussis,trypanosomiasis,staphylococcus aureus infection and systemic lupus erythematosus were enriched to two differentially expressed proteins.11 signal pathway,such as pertussis,trypanosomiasis,staphylococcus aureus infection and systemic lupus erythematosus,et al.were enriched to Complement C3.Nine signal pathways,such as PI3K-Akt signal pathway,focal adhesion,actin cytoskeleton regulation,et al.were enriched to Fibronectin 1.Conclusion The therapy of promoting blood circulation and removing blood stasis is remarkable on treating LIDP patients with blood stasis syndrome.Apolipoprotein A1,Apolipoprotein M,Apolipoprotein C3,Fibronectin 1 and Complement C3may be the potential target serum protein of therapy of promoting blood circulation and removing blood stasis for the LIDP patients with blood stasis syndrome.

Intervertebral disc displacement；Pattern of syndrome；Blood act stasis remov agents；Proteomics

国家自然科学基金资助项目(81260544)；广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019194)；广西医疗卫生适宜技术研究与开发课题(S201307-1)

530023广西南宁市，广西中医药大学第一临床医学院研究生(关鹏，邰志洪，桂裕昌);广西中医药大学第一附属医院骨科(尹利军，韦家鼎，李智斐)；广西医科大学第一附属医院康复医学科(许建文)；广西中医药大学生物化学教研室(韦玉兰)

许建文，530021广西南宁市，广西医科大学第一附属医院康复医学科；E-mail：1049662254@qq.com

R 681.53

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.32.011

2016-04-16；

2016-09-27)