Hedgehog信号通路中下游转录因子GLI1在鼻咽癌中的表达*

姚利 聂国辉 蔡智 陆兴

·实验研究·

Hedgehog信号通路中下游转录因子GLI1在鼻咽癌中的表达*

姚利1聂国辉1蔡智1陆兴1

目的 检测hedgehog信号通路下游转录因子GLI1在鼻咽癌组织中的表达活性及其临床病理意义。方法 50例鼻咽癌组织标本，免疫组织化学染色法检测GLI1的表达活性水平，并与26例鼻咽慢性炎症组织标本检测结果进行比较，分析其表达差异的临床病理意义。结果 鼻咽癌组织GLI1表达水平较鼻咽慢性炎症组织显著升高（P<0.05），其活性水平与颈淋巴结转移显著相关（P<0.05），并显示随瘤细胞浸润程度加剧而活性升高趋势，但无显著性意义（P>0.05）。结论 鼻咽癌细胞Hedgehog信号通路下游转录因子GLI1显示异常活化，可能在鼻咽癌的进展过程中起重要作用，有希望成为鼻咽癌诊断及治疗的分子靶点。

鼻咽癌；GLI1蛋白；表达活性；临床病理意义

鼻咽癌占全身恶性肿瘤的30.97%，占头颈部癌的78.08%，鼻咽癌淋巴道转移率高达60%～86%。广东省是高发区。浸润和转移是NPC致死的主要原因。它的发生是一个多因素协同、多阶段发生的复杂过程，同时也是细胞增殖分化与细胞凋亡平衡失调的过程。近年来通过对肿瘤的研究[1]，人们发现肿瘤细胞和细胞生长有相似之处，一些在胚胎发育、细胞分化过程中起重要调控作用的信号传导通路在肿瘤的发生、发展中也起着重要作用。研究表明[2,3]，在多种恶性肿瘤中均发现SHH通路的异常激活。因此本实验通过检测鼻咽癌组织中该SHH信号通路中下游转录因子GLI1在鼻咽癌组织的表达，探讨其在鼻咽癌组织中的作用及临床意义。

材料与方法

1 一般资料

以2009年3月～2014年1月北京大学深圳医院50例鼻咽癌患者的石蜡包埋标本为研究材料(NPC组)。其中,男38例,女12例；年龄20～71岁,平均40岁。均为鼻咽非角化性癌。病例经HE切片再次复检确诊。其中根据中国“鼻咽癌2008分期”的方案[13]，将临床T分期分为T1期10例,T2期21例，T3期14例,T4期5例。经过B超检查及活检证实NPC组又分为颈淋巴结转移组(30例)和非转移组(20例)。患者均未进行过放射治疗及化学药物治疗。对照组26例慢性鼻咽黏膜黏膜来自同时期的活检鼻咽黏膜炎性组织标本，男16例，女10例；年龄20～65岁，平均38岁。

2 方法

免疫组化方法：兔抗人多克隆抗体Glil均购自美国Santa Cruz公司，工作浓度分别为1∶150。Elivision Plus试剂盒、DAB显色剂购自福州迈新公司。免疫组化步骤按试剂盒说明进行，手术切除的组织标本经石蜡包埋切片，连续切片每张厚约5μm。阳性对照采用肺癌组织,用PBS代替一抗和二抗作阴性对照。做HE染色和采用Elivision Plus二步法免疫组化染色。

3 免疫组化结果判定

在不知任何背景资料的情形下,采用双盲法进行判定，Glil蛋白主要定位在细胞核或胞质，以出现棕褐色颗粒为染色阳性。显微镜下观察,肿瘤未着色或着色<10%为阴性(-),肿瘤细胞着色在11%～25%为阳性(+)，26%～50%(++)，>51%(+++)，结果用百分率表示。

4 统计学方法

采用SPSS 13.0进行统计学析计数资料组间比较采用卡方检验，多个样本均数比较的方差检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 Glil在不同鼻咽组织中的表达（表1）

Glil蛋白阳性表达率为52%,阳性表达主要在细胞质及细胞核内。阳性细胞胞浆或胞膜呈棕黄色,阳性颗粒粗细不等。阴性细胞胞浆、胞膜不着色,胞核呈紫蓝色。在癌组织和慢性炎性鼻咽黏膜中均有表达，炎性鼻咽黏膜组织可见少量着色。癌组织中阳性分布呈异质性,且染色程度存在差异，在癌巢附近的肿瘤细胞染色更为明显（图1～5）。由于细胞的阳性强度分组统计无统计学意义，故在统计中合并一起作为阳性例数作为分析研究。

图1 Gli1蛋白在鼻咽炎性黏膜组织中多为阴性表达，部分上皮弱阳性表达.×200

图2 Gli1蛋白表达于鼻咽癌细胞胞核或胞浆中，呈棕黄色着色.×400

图3 Gli1蛋白在癌巢附近的上皮细胞部分也呈阳性表达.×200

图4 Gli1蛋白表达在不伴淋巴结转移的癌细胞多为弱阳性表达.×200

图5 Gli1蛋白表达在伴淋巴结转移的癌细胞多为强阳性表达.×200

表1 Glil在不同鼻咽组织中的表达

2 Glil的表达与NPC的临床特征关系（表2-4）

Gli1蛋白表达均与年龄性别无关。统计上由于不同T分期各自例数较少，根据统计要求需要故将早期（T1期+T2期）和中晚期（T3期+T4期)病例分别合并统计，发现Gli1表达随临床浸润程度升高其表达上调,但无显著性差异(P>0.05，见表3)。Gli1在淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组(P<0.05)。

表2 Glil的表达与NPC的临床特征关系

表3 Glil的表达与鼻咽癌临床T分期的关系

讨论

N tisslein—Volhard等[4]于20世纪80年代首次在果蝇中发现了hed gehog(HH)基因，认为在人体胚胎发育中具有调节细胞增殖与分化的作用。而在人类基因组中，HH基因具有三个同源基因：Sonic hedgehog(Shh)，Desert hed gehog(Dhh)和 Indian hedgehog(Ihh)，分别编码Shh，Dhh，Ihh蛋白。其中Shh研究最为广泛，位于7号染色体长臂的3区6带(7q36)编码一种与早期胚胎发育密切相关的分泌蛋白，在人体多种细胞组织中都有分布。新近的研究表明[5]，Shh蛋白参与到了基因的转录，细胞因子以及某些功能蛋白的表达，器官的正常构建，肿瘤的发生等一系列事件。Shh的信号传导通路转导包括以下相关分子的参与[6]：两个细胞膜跨膜蛋白Patched(Ptch)和Smoothened(Smo)蛋白，锌指结构转录因子家族Gubitus interruptus(Gi)。在脊椎动物体内，Ptch具有Ptchl和Ptch2两者亚型，而Smo为七次跨膜的单一肽链，在脊椎动物中Gi又称Gli家族，具有Glil，Gli2，Gli3三种亚型。静止状态下Ptch与Smo结合形成复合体，使得Smo的活性被抑制，当Shh出现时，Shh可竞争性的与靶细胞膜上的Ptch结合，从而解除Ptch对Smo的抑制，Smo发生活化。在脊椎动物体内，Gli可与Costal2蛋白，Sup—pressor of Fused(SuFu)蛋白，Fused激酶形成蛋白复合物，活化的Smo可磷酸化该复合物，使得Gli被释放出来活化的Gli即可进入细胞核，从而调控靶基因的转录[7]。而这些靶基因包括了诸如Wnt，Nmyc，Gas1等与人体正常胚胎发育，肿瘤的发生与发展，血管的形成等密切相关的基因，从而调控着细胞的生长，分化与增殖等过程。

表4 Glil的表达与鼻咽癌淋巴结转移的关系

GLI1基因[8]定位于人类12号染色体q13.2-13.3,为编码锌指蛋白家族成员之一。它包括Gli1, Gli2,Gli3。其中Gli1,Gli2主要激活Shh通路下游基因转录功能，而Gli3则起抑制作用。其中，Gli1是Shh通路下游中起最主要作用的转录调控因子。Gli1通过与CyclinD2、VEGF、Bcl-2等目的基因特定序列结合，直接上调这些目的基因的转录表达，从而发挥抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖和转移的作用[9]。目前证实[10]，Glil可能通过以下机制直接诱导肿瘤的发生：①诱导G／S期细胞周期调节蛋白表达从而促进细胞的增殖；②直接诱导抗凋亡因子B c l-2的表达以抑制凋亡；③直接促进上皮组织向间质的转化，使肿瘤的侵袭性增强。

本研究发现，鼻咽癌组织中的G1i1表达率52%，而鼻咽炎性组织仅阳性率为（19.2%）说明在鼻咽癌组织中G1i1蛋白表达显著上调。在有颈淋巴结转移的鼻咽癌患者G1i1表达率63.3%明显高于无颈淋巴结转移的鼻咽癌患者（35%），说明G1i1表达促进了鼻咽的颈淋巴结转移，据报道[11]Shh信号通路的转录因子G1i1蛋白在胰腺癌细胞中存在旁分泌形式，是肿瘤微环境的重要调节因素，可以促进肿瘤的血管和淋巴管新生。这些研究结果说明，Shh信号通路的异常激活通过G1i1蛋白可能促进肿瘤淋巴管新生。进一步促进肿瘤细胞发生淋巴管侵袭和转 移。同时，本研究中NPC组织G1i1表达随浸润程度进展有所增高但无显著性差异，可能与病变阶段不同，例数过少等有关。刘刚等[12]也在对鼻咽癌干细胞的MiRNA的研究发现多种标志物与鼻咽癌临床分期无相关性，但与鼻咽癌的转移明显相关，对它们的深入研究了解鼻咽癌转移的机制才有可能提高有效的治愈率。

因此，G1i1蛋白在鼻咽中的表达可以作为 判断鼻咽癌转移和预后的重要指标,鼻咽癌组织中异常激活的Shh信号通路中其下游转录因子Glil蛋白可能直接参与了肿瘤的发生、发展和转移，有可能成为鼻咽癌转移标记物和生物学治疗新的靶点。

1 Barakat MT，Humke EW，Scott MP.Learning from Jekyll tocontrol hyde：Hedgehog signaling in develop ment and cancer[J]．Trends MolMed，2010，16(8)：337-348.

2 Kawabata A，Kawao N．Physiology and pathophysiology of proteinase—activated receptors(PARs)：PARs in the respiratory system：cellularsignaling and physiological／pathological roles[J]．J Pharmacol Sci．2005 Jan；97(1)：20-24.

3 陈筠，张双卫，王银全．苦参碱对人胆管癌细胞QBC939增殖和凋亡的影响[J]．中华实验外科杂志，2005，22(5)：627-627．

4 Nusslein—Volhard C，Wieschaus E．Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila[J]．Nature，1980，287：795-801．

5 Nybakken K，Perrimon N．Hedgehog signal transducfion：recent findings[J]．Current Opinion in Genetics＆Development，2002，12：503-511.

6 Ruiz i Ahaba A，Sanchez P，D ahmane N．Gliad hedgehog in cancer：tumours，embr yos and stem cens[J]．Nature Rev Cancer，2002，2：361-372．

7 Yang L，Xie G，Fan Q，et a1．Activation ofthe hedgehog—signaling pathway in human cancer and the clinical implications[J]．Once—gene，2010，29：469-481．

8 Yao S，Lum L，Beachy P．The ihog cell-surface proteins bind Hedge—hog and mediate pathway activation[J]．Cell，2006，125(3580)：343-357．

9 Modon JP，Mongeau ME，Klim stra DS．et a1．Sonic hedgehog acts at multiple stages during pancreatic tumorigenesis[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(12)：5103-5108．

10 冯福彬，庄静，刘瑞娟.Hedgehog信号通路相关蛋白Gli1在乳腺癌组织中的表达及其意义，临床肿瘤学杂志,2015，20（2):112-115.

11 夏含笑,刘陶文.Hedgehog信号通路对肿瘤脉管新生调控的研究进展,实用医学杂志,2015,31(3)：496-498.

12 刘刚，田道法，张莉，等.鼻咽癌干细胞miRNA表达研究.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2014,22(5):327-332.

13 中国鼻咽癌临床分期工作委员会.鼻咽癌92分期修订工作报告[J].中华放射肿瘤学杂志，2009,18(1):2-6.

（收稿:2016-06-07 修回：2016-07-01）

Expressive level assaying of transcript factor GLI1 in the downstream of Hedgehog signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma tissues

YAO Li,NIE Guohui,CAI Zhi,LU Xing
Department of Otolaryngology,Beijing University Shenzhen Hospital,Guangdong,518036,China

Objective To detect the expressive level of GLI1 in the tissue samples of nasopharyngeal carcinoma (NPC)to evaluate its implications in clinical pathology of NPC cases.MethodsThe expressive level of GLI1 was determined by immunohistochemistry in the tissue specimens from 50 NPC cases,with the tissue samples from 26 cases of chronic nasopharyngitis as controls.Then,analyzed were its implications of changing in expressive level in clinical pathology in a comparative way.Results The expressive activity of Gli1 was significantly elevated in NPC tissue samples than that in controlling ones of chronic nasopharyngitis tissue(P<0.05),with an obvious correlation between the expressive level of GLI1 and the status of cervical lymph node metastasis(P< 0.05).Furthermore,it was shown that there was an increased tendency in the expressive level of Gli1 with infiltrating degree of tumor cell in the focus tissue while no significantly statistical significance found(P>0.05).The expressive activity of Gli1 was significantly elevated in NPC tissue samples than that in controlling ones of chronic nasopharyngitis tissue(P<0.05),with an obvious correlation between the expressive level of GLI1 and the status of cervical lymph node metastasis(P<0.05).Furthermore,it was shown that there was an increased tendency in the expressive level of Gli1 with infiltrating degree of tumor cell in the focus tissue while no significantly statistical significance found (P>0.05).Conclusions As a transcript factor in the downstream of Hedgehog signaling pathway in NPC cells,abnormal activation of GLI1 may play an important role in the initiation and development of NPC.Therefore,it can be taken as an ideal molecular target for diagnosis and therapy of NPC in future.

Nasopharyngeal carcinoma;GLI1 protein;Expressive activity;Clinical pathological implications

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.001

广东省深圳市科技计划项目（编号：201302072）

1广东省深圳市北京大学深圳医院耳鼻咽喉科（518036）

陆兴，主任医师.Email:yllp20@tom.com