免疫球蛋白M和糖蛋白96表达与鼻咽癌放疗敏感性的关系*

赵飞鹏 费樱平 冯华君 徐伟 许胜恩 赵冲 覃纲

免疫球蛋白M和糖蛋白96表达与鼻咽癌放疗敏感性的关系*

赵飞鹏1费樱平1冯华君1徐伟1许胜恩1赵冲1覃纲1

目的 研究免疫球蛋白M（immunoglobulinM,IgM）和糖蛋白96（glycoprotein 96,gp96）在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）中表达与放疗敏感性的关系。方法 按照世界卫生组织关于实体肿瘤放射治疗敏感性评估标准选取60例NPC放疗前组织标本，其中30例为放疗敏感组，30例为放疗耐受组；并取30例同期鼻咽部慢性炎症作为对照；另选取同期放射治疗3-6个月后颈部残留淋巴结转移病灶并行颈部淋巴结清扫者9例；采用免疫组化SP法检测IgM和gp96的表达，比较分析IgM和gp96表达与NPC放疗敏感性的关系。结果 IgM和gp96在NPC组织中均显著高表达。IgM在NPC放疗耐受组的表达率（80.0%）显著高于放疗敏感组（36.7%）（P<0.05）；gp96在NPC放疗耐受组的表达率（83.3%）也显著高于放疗敏感组（46.7%）（P< 0.05）；IgM和gp96在NPC组织中的表达呈正相关性（r=0.443，P<0.05）。IgM与gp96在NPC放疗后颈部淋巴结转移残留组织中高表达率分别为88.9%和77.8%。结论 IgM和gp96在NPC中高表达，且其表达水平与NPC放疗敏感性呈负相关，提示它们可能作为预测NPC放疗敏感性的指标；IgM和gp96在NPC中表达呈正相关，同时检测两个指标可能会提高预测NPC放疗敏感性的准确度，以便制定更为有效的治疗方案。

鼻咽癌；免疫球蛋白M；糖蛋白96；放疗敏感性

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种原发于鼻咽黏膜的头颈恶性肿瘤，其发病与遗传、EB病毒感染及环境等因素密切相关。NPC目前采用以放疗为主的综合治疗，文献报道NPCⅠ期和Ⅱ期患者的5年总体生存率分别能够达到90%和84%，但Ⅲ期和Ⅳ期患者采用同期放化疗后5年总体生存率仅维持在70%左右；部分患者存在放疗抵抗以致肿瘤残留及复发，是NPC治疗失败的主要原因[1]。解析NPC放疗抵抗的机制和寻找提高放疗敏感性的抗肿瘤靶标，对提高NPC放疗效果及患者生存率显得尤为迫切和重要。课题组前期研究结果显示IgM蛋白在NPC细胞及组织中存在高表达，且抗人IgM抗体对NPC细胞及移植瘤有抑制作用，但是目前对于NPC中IgM表达与其放疗敏感性的关系尚不明确。本研究采用免疫组化SP法检测IgM和gp96在NPC放疗敏感组及耐受组中的表达，分析IgM和gp96在NPC中的表达与放疗敏感性的关系，探讨IgM在NPC组织中表达对NPC放射治疗的作用和临床意义，以期寻找预测NPC放疗敏感性的指标。

材料与方法

1 临床标本

选取2013年7月～2015年3月就诊于西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科且临床资料完整的60例NPC组织标本，其中男28例，女32例，年龄23～78岁，中位年龄49岁。对照组：同期就诊于我院经病理确诊为鼻咽部慢性炎症的组织标本30例，其中男15例，女15例，年龄25～73岁，中位年龄49岁。另选取同期放疗结束3～6个月后颈部残留转移淋巴结患者9例。

2 放疗效果评定

疗效评价按照WHO实体肿瘤的反应评估标准，在NPC患者放射治疗结束3个月后复查鼻咽部MRI扫描，根据肿瘤的消退情况，对肿瘤放射治疗敏感性进行近期评估。评估标准如下：①MRI检查显示鼻咽部没有显著的软组织增厚、隆起或鼻内镜检查见鼻咽部黏膜光滑，无黏膜糜烂或新生物隆起，并且活检没有发现癌细胞，判定为放疗敏感；②MRI检查显示鼻咽部软组织显著增厚，或鼻内镜下见鼻咽黏膜局部粗糙隆起且鼻咽部新生物活检病理检查发现癌细胞者，这类患者诊断为局部肿瘤残余，表明对放疗耐受[2]。

3 主要实验试剂

兔抗人IgM单克隆抗体（SANTA CRUZ公司，美国），兔抗人GP96单克隆抗体（Bioworld公司，美国），兔抗人CD20抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；免疫组化超敏SP试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），DAB显色试剂盒、二氨基联苯胺、免疫组化专用PBS及0.01M枸橼酸盐缓冲液（均购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。

4 主要实验步骤

采用免疫组化SP法：取组织石蜡块，切片、脱蜡，高压抗原修复，山羊血清封闭；依次分别滴加以PBS稀释为1:50的兔抗人IgM一抗或1:500的兔抗人GP96一抗；PBS冲洗，滴加二抗；滴加链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶；DAB 显色，苏木素复染；操作严格按照试剂说明书进行。

5 免疫组化染色结果判断

由两位实验人员在高倍镜（×400）下，每张切片随机选取10个染色良好视野，结合阳性细胞百分数和染色强度进行结果判定。根据染色阳性细胞的百分率不同分别计为0～3分：0=＜5%；1=5～25%；2= 25～50%；3=＞50%。染色强度0、1、2、3分别代表染色阴性、轻度、中度及重度。最终结果由这两个结果得分相加，0～1分记为-，2～3分记为+，4～5分记为++，6分记为+++。0～3分的切片记为低表达，4～6分为高表达。如果两位实验人员评定意见不一致，可经讨论后达成一致，必要时可申请第三者参与判定。

6 统计学处理

采用SPSS 18.0 for Windows统计分析软件进行统计学分析，采用χ2检验、计算Fisher确切概率，建立IgM表达水平与gp96表达水平的配对四格表，计算Cramer氏系数V值，相关系数r值及P值，检验水准α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1 IgM、gp96在NPC及鼻咽部慢性炎性黏膜组织中的表达情况

IgM表达主要位于NPC细胞浆中，细胞核表达少见（图1-A）。利用CD20标志B淋巴细胞排除肿瘤组织中B细胞浸润污染（图1-E）。NPC中IgM高表达率为58.3%，对照组鼻咽部慢性炎性黏膜组中IgM高表达率为30.0%（图1-B），两者有统计学差异（χ2=6.425，P＜0.05）。gp96在NPC细胞膜及细胞浆中都存在表达（图1-C），NPC中gp96高表达率为65.0%，对照组中gp96高表达率为20.0%（图1-D），两者有统计学差异（χ2=16.200，P＜0.05）。IgM、gp96在NPC中存在高表达（表1）。

图1 IgM、gp96在NPC及鼻咽炎性黏膜组织中的表达（SP×400）

表1 IgM、gp96在NPC及鼻咽部炎性黏膜组织中的表达

2 IgM、gp96在NPC放疗敏感组及放疗耐受组患者中的表达情况

60例NPC病例标本中，35例IgM高表达（图2-A），25例IgM低表达（图2-B），NPC放疗敏感组及放疗耐受组中IgM蛋白的高表达率分别为36.7%和80.0%，两者有统计学差异（χ2=11.589，P＜0.05）；39例gp96高表达（图2-C），21例gp96低表达（图2-D），NPC放疗敏感组及放疗耐受组中gp96蛋白的高表达率分别为46.7%和83.3%，两者有统计学差异（χ2=8.864，P＜0.05）。IgM、gp96均在放疗耐受组中表达较高，表明IgM、gp96表达水平与NPC的放疗敏感性呈负相关（表2）。

图2 IgM、gp96在NPC放疗患者中的表达差异（SP×400）

表2 IgM、gp96在NPC放疗患者中的表达

3 IgM、gp96在NPC患者中表达的相关性分析

60例NPC组织IgM与gp96的表达情况见表3；IgM低表达者25例，高表达者35例；gp96低表达21例，高表达39例；IgM、gp96两者共同低表达15例，共同高表达29例。统计分析得出，NPC样本组织中IgM与gp96的表达正相关（χ2=11.774，V= 0.758；r=0.443，P=0.001)，表3。

表3 IgM蛋白和gp96蛋白在NPC患者中表达的关系

4 IgM、gp96在NPC放疗后颈部淋巴结转移残留组织中的表达情况

NPC放疗3～6个月后颈部淋巴结转移残留组织中存在IgM、gp96的表达（图3）；在9例中，IgM低表达者1例，IgM高表达者8例，高表达率为88.9%；在9例中，gp96低表达者2例，gp96高表达者7例，高表达率为77.8%。

图3 IgM、gp96在NPC放疗后颈部残留淋巴结中的表达（SP×400）

讨论

NPC是我国南方及东南亚常见的恶性肿瘤，放射治疗是其主要的治疗手段，但放疗抵抗仍是治疗失败的主要原因，主要表现为局部复发或远处转移[1]。肿瘤分化程度及TNM分期仍是制定NPC放疗计划主要依据，但NPC对放疗的敏感性还受到复杂的分子机制调控。目前无法有效的区分NPC放疗抵抗亚群及NPC放疗抵抗的机制有待进一步研究，寻找放疗敏感性的分子标志物对NPC临床个体化治疗具有重要意义。

早在1991年，Cao等[3]在NPC的CNE2细胞系中分离出Tx基因并发现IgK轻链的JC片段。Hu等[4]发现IgM在许多上皮来源的肿瘤中表达，并可能参与肿瘤的免疫及生物学改变。在肝癌[5]，前列腺癌[6]，卵巢癌[7]中的IgM复合物也显著增高。本课题组前期证实NPC细胞系CNE-1和HNE-1中存在

IgM蛋白表达；IgM蛋白在NPC组织中高表达，并与NPC患者的临床预后密切相关[8]。本实验通过免疫组化SP法检测IgM在60例NPC和30例鼻咽部黏膜组织中表达，发现IgM在NPC组织中表达显著高于正常鼻咽黏膜组织，这与之前的研究结果相符合。

Ig在NPC中表达的具体作用机制还不清楚，但目前的研究多表明Ig具有促进肿瘤生长、增殖及转移的作用。Qiu等[9]发现阻断肿瘤内源性IgG可抑制肿瘤细胞的生长，提示IgG在肿瘤细胞的生长及存活中有重要作用。邓郁青等[10]通过转染Ig重链互补决定区3促使HT-29细胞Ig基因表达降低，从而影响肿瘤细胞的生长、凋亡等。Zheng等[11]通过用鼠抗人Igα抗体阻断肿瘤源性Igα的产生，HeLa和CNE1细胞增殖被显著抑制，表明肿瘤源性Ig有促进肿瘤生长的作用。Hu等[4]研究认为，IgM与CD79在癌细胞膜表面形成B细胞抗原受体样复合物，在细胞外信号的刺激下诱导快速钙通道激活，进一步促使PI3和PLC-γ2通路的激活，促进肿瘤细胞的增殖。我们前期研究表明，抗人IgM抗体可以显著抑制HNE-1细胞增殖，抗人IgM抗体可以诱导HNE-1细胞凋亡和抑制HNE-1裸鼠移植瘤的生长，提示IgM可能与NPC的发病机制有关。

现关于IgM表达与NPC放疗敏感性的研究较少，本研究发现IgM在放疗耐受组的高表达率（80.0%）显著高于敏感组（36.7%），NPC放疗3～6个月后颈部淋巴结转移残留组织中IgM高表达，提示IgM在NPC中的高表达可能与NPC放疗耐受相关。处于不同细胞周期的肿瘤细胞对放射的敏感性也不一样。课题组前期研究表明抗人IgM抗体可以影响HNE-1细胞周期，导致G1期细胞减少，细胞周期阻滞于S期；而S期细胞增加，可降低肿瘤细胞抗射线的促凋亡作用而产生射线抵抗。此外，研究发现：IgM可通过p53非依赖方式促进p21的激活而调控细胞周期，使肿瘤细胞处于休眠期（G0期），抗IgM抗体可增加细胞凋亡[12]。因此，IgM的高表达可能通过调控肿瘤的细胞周期使其处于射线不敏感的G0/G1/S期，从而导致NPC放疗抵抗。

有研究表明gp96的表达与肿瘤的发生、发展密切相关。Hodorov等[13]发现gp96在乳腺癌组织表达显著高于癌旁组织。乳腺癌淋巴结阳性患者gp96的表达水平显著高于淋巴结阴性者，gp96表达与肿瘤的扩散转移相关并可作为肿瘤预后不良的指标[14]。本研究发现gp96在NPC中的表达显著高于正常鼻咽部黏膜组织。高表达gp96的口腔癌患者的无瘤生存期和总存活期较短，并对放疗有一定的抵抗性[15]。Chang等[16]在NPC及头颈肿瘤放疗抵抗的亚克隆细胞系中，使用cDNA微阵列、蛋白质组学和网络分析，发现gp96是一种调节放疗抵抗亚群的基因或蛋白，敲除gp96可以增加肿瘤的放疗敏感性；进一步研究发现gp96高表达与肿瘤分期及放疗敏感密切相关，高表达gp96的NPC患者预后较差。同样，Lin等[17]发现敲除gp96后无论在细胞还是裸鼠体内均可提高放疗敏感性。本实验中放疗抵抗组gp96的表达水平显著高于放疗敏感组，且gp96在NPC放疗后颈部淋巴结转移残留组织中高表达，这与已有的研究相符合。

本研究中IgM和gp96表达成正相关（r=0.443，P＜0.05），表明两者在NPC的发生发展、抗凋亡、细胞修复等过程中可能有着协同作用。Tramentozzi[18]等在研究gp96对人血液中单核细胞产生Ig的影响中发现，gp96可以通过细胞因子样作用激活体液免疫，促进B细胞的成熟与分化。王慧贤等[19]发现gp96与IgG在肺癌中共表达，推测它们在肿瘤的发生、发展中有协同作用，可能参与了肿瘤的免疫及免疫逃逸机制。但IgM和gp96在NPC中共表达及与放疗的关系，需进一步研究。

本研究通过免疫组化SP法检测IgM和gp96在NPC放疗敏感组及耐受组中表达水平，发现IgM和gp96在NPC中高表达，且其表达水平与NPC放疗敏感性呈负相关，提示它们可以作为预测NPC放疗敏感性的指标；IgM和gp96在NPC中表达呈正相关，同时检测两个指标可能会提高预测NPC放疗敏感性的准确度，以便制定更为有效的治疗方案。但IgM和gp96是如何参与NPC的放疗抵抗机制仍不明确，需进一步研究。

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（收稿:2016-10-09）

The relationship between expression of Immunoglobulin M and glycoprotein 96 and radiosensitivity in human nasopharyngeal carcinoma

ZHAO Feipeng,FEI Yingping,FENG Huajun,XU Wei,XU Sheng-en,ZHAO Chong,QIN Gang
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou,Sichuan 646000,China

Objective To study the relationship between the expression of ImmunoglobulinM(IgM)and glycoprotein 96(gp96)in nasopharyngeal carcinoma (NPC)and sensitivity to radiotherapy.Methods According to the WHO on solid tumor radiosensitivity evaluation criteria,60 cases of NPC tissue specimens before radiotherapy,including 30 cases of radiation sensitive group,30 cases of radiation resistance group,were chosen,and 30 cases of chronic nasopharngitits as control group;9 cases of residual cervical lymph node were also selected in cervical lymph node dissection after radiotherapy 3-6 months.The expression of IgM and gp96 were detected by immunohistochemistry SP method,and the relationship between the expression of IgM and gp96 and the radiosensitivity of NPC was analyzed.Results IgM and gp96 were both over-expressed in NPC tissues.The expression of IgM in radio-resistant group (80.0%)was significantly higher than radio-sensitive group(36.7%)(P<0.05).Also,the expression of gp96 in radio-resistant group (83.3%)was significantly higher than radio-sensitive group(46.7%)(P<0.05).The expression of IgM and gp96 had positive correlation in NPC(r=0.443,P<0.05).The high expression of IgM and gp96 in residual metastatic neck lymph node after radiotherapy were 88.9% and 77.8%separately.Conclusions IgM and gp96 were both over-expressed in NPC.Both of them had negative correlation with radiosensitivity of NPC,which could be a useful predictor of radiosensitivity in NPC.The expression of IgM and gp96 had positive correlation in NPC.Detecting the expression of IgM and gp96 can more accurately predict the radiosensitivity of NPC.

Nasopharyngeal Carcinoma;Immunoglobulin M;Glycoprotein 96;Radiosensitivity

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.002

国家自然科学基金项目（81602570），泸州市人民政府-四川医科大学科技战略合作项目[2015LZCYD-S02(4/11)]

1西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科（646000）

覃纲,主任医师.Email:qin-lzm@163.com