高效液相色谱法测定祛风止痛片中乌头碱的含量

曹稳根，翟科峰，段 红，董 增

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000



高效液相色谱法测定祛风止痛片中乌头碱的含量

曹稳根，翟科峰，段 红，董 增

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

建立祛风止痛片中乌头碱的高效液相色谱测定方法。色谱柱为Skim-pack vp-ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；流动相为甲醇-0.1%三乙胺(65∶35，v/v)；流速0.8 mL/min；检测波长235 nm；柱温35℃。乌头碱在0.1504～0.3384 μg范围内峰面积与进样量有良好的线性关系(r=0.9991)，平均回收率为98.62%，RSD为1.19%。本方法简便可行，准确可靠，重复性好，可用于祛风止痛片制剂的质量控制。

祛风止痛片；乌头碱；高效液相色谱法；甲醇-0.1%三乙胺

祛风止痛片为国家发明专利品种，也是国家中药保护品种，主要由老鹳草、槲寄生、续断、威灵仙、独活、制草乌和红花七味药复方组成，具有祛风止痛、舒筋活血、强壮筋骨等功效，临床用于治疗四肢麻木、腰膝疼痛、风寒湿痹等症，是治疗风湿、类风湿关节炎的理想药物，疗效确切[1-6]。制剂中制草乌辛、苦、热，有毒，具有祛风除湿、温经止痛的作用，用于风寒湿痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛等疾病的治疗，其中乌头碱既是其药效成分，又是毒性成分，使用不慎极易引起中毒[7-8]。为保证临床用药安全有效，控制祛风止痛片制剂质量，本文建立了祛风止痛片中乌头碱的高效液相色谱测定方法，为祛风止痛片制剂的质量控制提供一定的依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

LC-20AT岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；U-3310紫外分光光度计(日本Hitachi公司)；BP211型电子天平(德国赛多利斯公司)；Millipore simplicity -185型超纯水器(美国密里博公司)；KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

乌头碱(批号：720-9807，中国药品生物制品检定所)；祛风止痛片(批号20080702，20090707，20100103，安徽雪枫药业有限公司)；甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)；其他试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Skim-pack vp-ODS(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%三乙胺溶液(65∶35，v/v)；流速：0.8 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：35℃；进样量：10 μL。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液

精密称取乌头碱对照品0.0047g，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，配制成188 μg/mL的乌头碱母液。用时稀释10倍，即移取1 mL母液用甲醇定容到10 mL容量瓶中，稀释成浓度为18.8 μg/mL的对照品溶液。

1.3.2 样品溶液

取同一批号的祛风止痛片，去除包衣研成粉末，精密称取一定量粉末状样品置入250 mL具塞三角烧瓶中，加入浓氨水12 mL，放置30 min，加乙醚70 mL，超声处理30 min，微孔滤膜滤过，取续滤液，再放在50℃水浴锅中将乙醚挥发干，最后用甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶中，摇匀，即得。

1.4 方法专属性考察

按“1.2”色谱条件，记录对照品溶液和样品溶液色谱图，结果见图1。从图1可以看出，在该条件下样品溶液乌头碱的峰与其对照品溶液的峰保留时间一致，且分离良好，无其他干扰。

1.5 线性关系考察

分别准确移取浓度为18.8 μg/mL的对照品溶液 8、10、12、14、16、18 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积。以乌头碱对照品进样量为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=27950x-60698，r=0.9991。结果表明，乌头碱对照品的峰面积与进样量在0.1504～0.3384 μg范围内有良好的线性关系。

图1 对照品乌头碱(a)和样品(b)的色谱图

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

文献报道乌头类生物碱在230～240 nm下有较大的吸收峰，如粟贵[9]等报道检测波长为230 nm，辛杨[10]等报道检测波长为235 nm。本实验对乌头碱的甲醇溶液进行了紫外吸收光谱扫描。结果表明，乌头碱在235 nm 处有最大吸收峰，在此波长下测定时，峰面积大，检测灵敏度高，故选择235 nm为检测波长。

2.2 流动相的选择

试验考察了不同比例的甲醇-0.1%三乙胺(60∶40，65∶35，70∶30，75∶25)流动相对峰形和保留时间的影响。结果表明，甲醇∶0.1%三乙胺流动相为65∶35时，分离最好，峰形好，保留时间为15.75 min；60∶40时，保留时间长，虽然分离好，但峰形较宽；70∶30和75∶25时，保留时间短，峰形尖锐，但分离不好。因此，最终确定甲醇-0.1%三乙胺(65∶35，v/v)为流动相。

2.3 精密度试验

准确移取浓度为18.8 μg/mL的对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录乌头碱峰面积。结果峰面积的RSD为0.27%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取批号为20100103的同一样品溶液10 μL，分别在1、2、4、6、8、24 h后进样，记录峰面积。结果峰面积的RSD为0.67%，表明样品溶液在24 h内保持稳定。

2.5 重复性试验

准确称取批号为20100103样品6份，按“1.3.2”的方法制备样品溶液。按照“1.2”的色谱条件下进样，外标法计算乌头碱的含量。结果乌头碱含量RSD为0.76%，表明重复性好。

2.6 加样回收试验

准确称取批号为20100103样品6份，分别准确加入浓度为18.8 μg/mL的对照品溶液1 mL，按“1.3.2”的方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定含量并计算加样回收率。结果测得样品乌头碱平均回收率为98.62%，RSD为1.19%，结果见表1。

表1 乌头碱加样回收率试验结果

2.7 样品含量测定

表2 祛风止痛片中乌头碱含量测定结果 n=3

取3批不同批号的祛风止痛片样品，按“1.3.2”项下的方法制备样品溶液，按同样的色谱条件下记录峰面积并计算乌头碱的含量，结果见表2。

3 结 论

本实验建立的HPLC测定方法简便可行，准确可靠，稳定性好，在0.1504～0.3384 μg范围内峰面积与进样量有良好的线性关系，可用于祛风止痛片制剂中乌头碱的检测。

[1]张道荣,郭永振,张琦.祛风止痛片的制剂药物及其制备方法、质量控制方法:ZL200510097337.X[P].2009-05-13

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010：968

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[6]段红,翟科峰,曹稳根,等.正交试验法优选祛风止痛片中制草乌、独活的合提工艺[J].中成药,2010,32(8):1421-1424

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[9]粟贵,廖林川,颜有仪,等.HPLC同时测定生物样品中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的含量[J].中国药学杂志,2009,44(12):946-950

[10]辛杨,王淑敏,刘志强.高效液相色谱法测定草乌叶中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱[J].国外医药：植物药分册，2008,23(4):170

(责任编辑：刘小阳)

2016-08-20

安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2012A264)。

曹稳根(1964-),安徽东至人,硕士，教授,主要研究方向：生化药物分析。

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.11.032

R284.2

A

1673-2006(2016)11-0122-03