肺结核潜伏期和活动期患者外周血miR-29a和IFN-γ水平变化*

詹 燏 刘水逸 吴唐维 石丽峰 刘怡雯 张红梅 汪 慧 卢忠心



肺结核潜伏期和活动期患者外周血miR-29a和IFN-γ水平变化*

詹 燏 刘水逸 吴唐维 石丽峰 刘怡雯 张红梅 汪 慧 卢忠心

目的：分析肺结核(TB)潜伏期和活动期患者血浆miR-29a、γ干扰素(IFN-γ)mRNA和血清IFN-γ水平变化及其相关性。方法：选择活动期TB患者(活动期TB组)27例、潜伏期TB患者(潜伏期TB组)22例及非TB患者(对照组)30例；采用逆转录荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组血浆miR-29a水平和单个核细胞IFN-γ mRNA水平，采用ELISA检测各组血清IFN-γ水平；比较各指标水平组间差异，分析两结核组miR-29a与IFN-γ mRNA的相关性。结果：活动期TB组miR-29a显著高于潜伏期TB组和对照组(P<0.01)；与对照组比较，潜伏期TB组和活动期TB组单个核细胞IFN-γ mRNA水平和血清IFN-γ水平均降低(P<0.01)，活动期TB组较潜伏期TB组更低(P<0.05)。活动期TB组和潜伏期TB组血浆miR-29a水平与单个核细胞IFN-γ mRNA水平均呈显著负相关(r分别为-0.697、-0.559，P<0.05)。结论：miR-29a可通过调控靶基因IFN-γ mRNA表达，参与TB的发生发展。

活动性肺结核；潜伏感染；miR-29a；干扰素-γ

结核病(Tuberculosis，TB)是结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，其发病率近年有增加趋势，新发病例主要由潜伏性结核感染者(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)进展而来。miRNA是一类高度保守的单链小分子RNA，通过转录后水平调控mRNA参与细胞发育、分化、增殖、凋亡，DNA甲基化，DNA修复及抗炎反应和促炎反应等病理生理活动，与人类多种疾病相关[1]。与之高度同源的miR-29a参与免疫反应，可通过抑制靶基因干扰素-γ(IFN-γ)的产生，下调机体对结核分枝杆菌的免疫应答，从而有利于结核分枝杆菌感染[2]，被认为是TB发生的重要机制和诊断标志[3]。本文检测分析miR-29a及其靶基因IFN-γ mRNA在活动期TB和潜伏期TB患者外周血水平差异以及两者的相关性，进一步佐证miR-29a对TB发生发展的重要作用。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

选择2013-09—2014-11本院呼吸科首次诊断的活动期TB患者27例(活动期TB组)，年龄18—67岁，平均(37.90±10.20)岁，其中男14例，女13例；潜伏期TB患者22例(潜伏期TB组)，年龄20—71岁，平均(38.15±10.31)岁，其中男12例，女10例。活动期TB的诊断依据国家卫生部《肺结核诊断标准(WS288-2008)》[4]；潜伏期TB的诊断标准为仅结核菌IFN-γ释放试验阳性，无结核症状，胸部X光正常[5]。另选同期因咳嗽、咳痰、胸痛、咯血等症状来本院呼吸科就诊，经以下试验和检查排除结核菌感染者作为对照组：结核菌素试验(PPD)阴性或硬结小于15mm，结核菌IFN-γ释放试验阴性，胸部X光正常，共30例，男16例，女14例，年龄21—64岁，平均(37.5±9.85)岁。所有入选者均排除肿瘤、自身免疫性疾病和糖尿病等。各组性别(χ2=1.221)、年龄(F=2.78)分布差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 检测试剂和仪器

RNA提取试剂盒(AM1556，批号：00324879)、miR逆转录试剂盒(批号：1302109)、miR-29a逆转录引物(批号：P131202-006 H04)、miR-29a PCR引物(批号：P130319-004 G02)、内参miR-39逆转录引物(批号：P130402-000 H01)、内参miR-39 PCR引物(批号：130806-000 A12)均购自美国ABI公司；Trizol 试剂(批号：80802)购自美国Invitrogen公司；荧光定量PCR试剂盒(批号：50115)购自北京康为公司；逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司(批号：255600)；人淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋科技有限公司(批号：171403D)；IFN-γ ELISA检测试剂盒购于美国R&D公司(批号：886154)；IFN-γ和内参β-actin引物均由武汉生工合成。各种引物序列见表1。StepOnePlus荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；EnSpire全波长多功能酶标仪为美国PerkinElmer公司产品。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 逆转录荧光定量PCR检测血浆miR-29a水平：采集三组对象清晨空腹外周静脉血3ml于EDTA抗凝管中，4h内以相对离心力2 000g离心20min，取血浆储存于-80℃冰箱备检。检测前取冻存血浆，按AM1556试剂盒说明书步骤提取总RNA(A260/A280为1.8-2.0)后进行逆转录。逆转录体系为20μl：1μl总RNA，4μl 5×Reaction Mix反应混合物，2μl 10×SuperScript Enzyme Mix酶混合物，用焦炭酸二乙酯(DEPC)水补足至20μl；反应条件：37℃ 60min，95℃ 5min。然后按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR，反应体系20μl：10μl EXPRESS SYBR Green ERTMqPCR Super Mix反应混合物,0.4μl 10μmol/L miR-29a引物或内参miR-39引物，0.4μl 10μmol/L通用荧光定量PCR引物，0.04μl ROX参比染料，2μl cDNA和7.16μl DEPC处理水，混匀，离心，每个样本设3个复孔；反应条件：50℃预孵育2min，95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个循环扩增。60℃延伸时采集荧光信号。反应结束后直接得到样本的域值循环数，每个样本均计算平均值，通过平均值计算相对表达量。miR-29a的相对表达量=2-△CT，△CT=CT(miR-29a)-CT(miR-39)。

1.3.2 逆转录荧光定量PCR检测外周血单个核细胞IFN-γ mRNA水平：采集三组对象清晨空腹肘静脉血3ml于EDTA抗凝管中，4h内以相对离心力2 000g离心20min，弃上清，用淋巴细胞分离液按常规操作提取单个核细胞储存于-80℃冰箱备检。检测前取冻存单个核细胞，按Trizol试剂说明书步骤提取单个核细胞的总RNA(A260/A280为1.8-2.0)后进行逆转录PCR，反应体系15μl：1μl RNA，1.2μl逆转录引物，5×逆转录缓冲液3μl，逆转录酶0.75μl，DEPC水补足至15μl；混匀、离心；反应条件：37℃ 15min，98℃ 5min。最后依照荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR，反应体系20μl：4μl逆转录产物，IFN-γ上、下游引物各1μl或β-actin上、下游引物各1μl，10μl EXPRESS SYBR Green ERTMqPCR Super Mix反应混合物，双蒸水补足至20μl，混匀，离心；每个样本设3个复孔；反应条件：95℃预变性10min，95℃ 5s，60℃ 1min，40个循环扩增；72℃延伸10min。反应结束后直接得到样本的域值循环数，每个样本均计算平均值，通过平均值计算相对表达量。IFN-γ mRNA的相对表达量=2-△CT，△CT=CT(IFN-γ)-CT(β-actin)。

表1 引物序列

1.3.3 ELISA检测血清IFN-γ水平：采集三组对象清晨空腹外周静脉血3ml置于非抗凝管中，混匀后离心(3 000r/min)5min，取血清检测IFN-γ含量。严格按照IFN-γ试剂盒说明书操作，于酶标仪450nm测吸光度，建立标准曲线，计算各样本含量。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组血浆miR-29a水平比较

各组血浆miR-29a水平差异有统计学意义(P<0.01)；活动期TB组miR-29a显著高于潜伏期TB组和对照组(t=4.726、4.064，P<0.01)，潜伏期TB组和对照组之间差异无统计学意义(t=1.851，P>0.05)。见表2。

2.2 各组外周血单个核细胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平比较

表2 各组血浆miR-29a水平比较

注：与对照组和潜伏期TB组比较，1)P<0.01

各组单个核细胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，潜伏期TB组和活动期TB组IFN-γ mRNA水平均降低(t=5.511、7.016，P<0.01)；活动期TB组较潜伏期TB组更低(t=2.202，P<0.05)。与对照组血清IFN-γ水平比较，潜伏期TB组和活动期TB组均降低(t=20.267、15.082，P<0.01)，活动期TB组较潜伏期TB组更低(t=6.736,P<0.01)。而且，IFN-γ mRNA水平和IFN-γ血清水平从对照组到活动期TB组的逐渐降低趋势都具有良好一致性(r=0.582，P<0.01)。见表3。

表3 各组单个核细胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平比较

注：与对照组比较，1)P<0.01；与潜伏期TB组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.3 相关性分析

活动期TB组和潜伏期TB组血浆miR-29a水平与单个核细胞IFN-γ mRNA水平均呈显著负相关(r=-0.697、-0.559，P<0.01)，见图1。

图1 活动期TB组(左)和潜伏期TB组(右)血浆miR-29a与单个核细胞IFN-γ mRNA水平的相关分析图

3 讨 论

结核分枝杆菌引起的TB是一种严重危害人类健康的慢性传染性疾病，被我国列为重大传染病之一。WHO 2012年报道，2011年全球新增TB 870万，死亡110万，其中中国新增患者90万—110万，占全球发病人数的14%，位居全球第二位[6]。新发TB病例主要由LTBI进展而来，其中5%—10%的LTBI进展为活动期肺结核[7]，表明人类对结核分枝杆菌易感，且结核分枝杆菌容易躲避宿主免疫系统攻击，而在宿主体内长期潜伏，一旦机体免疫力下降，潜伏期人群即会进展为活动期TB。

miRNA是一类高度保守的单链小分子RNA，长度为18—25个核苷酸。成熟的miRNA可通过与靶mRNA的3’端非编码区结合而抑制靶mRNA的翻译或导致靶mRNA降解，发挥基因转录后的调节功能[8]。近年来研究证实，血液循环系统中miRNA广泛而稳定地存在，并随疾病的发生发展出现相应的特异性改变，成为疾病诊断的新型生物标志物[9-12]。已有研究表明，miR-29a在结核分枝杆菌感染不同时相有一定的表达差异，被认为是TB的诊断标志[13-15]。miR-29a可通过靶向IFN-γ，调控机体对结核分枝杆菌感染引起的免疫应答，从而对结核分枝杆菌感染发挥重要作用[2,16]。

本研究结果显示，活动期TB患者血浆miR-29a水平比潜伏感染者及对照者显著增高，与此同时，活动期TB患者和潜伏期TB患者单个核细胞IFN-γ mRNA水平明显降低，提示人体感染结核分枝杆菌后，miR-29a可能负向调控机体对病原体的免疫应答，降低机体抵抗力，诱发TB。血清中IFN-γ水平此时也明显降低，与IFN-γ mRNA表达下调呈良好一致性，因而检测血清IFN-γ水平也能反映miR-29a变化及辅助诊断TB。IFN-γ mRNA是miR-29a作用的靶基因，活动期TB患者外周血miR-29a升高，靶向IFN-γ mRNA，降解增加，存量减少，使机体抗结核能力降低，从而有利于结核分枝杆菌的体内增殖，是miR-29a调控IFN-γ致TB发生发展的可能机制。

综上所述，结核分枝杆菌感染可引起机体miR-29a表达上调，使其靶分子IFN-γ抗结核免疫作用下降，继而促进TB的发生发展。临床检测外周血miR-29a及其靶基因水平在结核分枝杆菌感染过程中的动态变化，对进一步分析、探讨miR-29a生物学作用和制定防治策略有重要意义。

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本文第一作者简介：

詹 燏(1975-)，女，汉族，硕士，副主任技师，主要从事微生物检验工作

1 周 烨，向俊宇，侯 晋，等. 微小RNA作为疾病标志物的研究进展[J]. 中华检验医学杂志, 2011,34(10):871-876.

2 Ma F, Xu S, Liu X, et al. The microRNA miR-29 controls innate and adaptive immune responses to intracellular bacterial infection by targeting interferon-γ[J]. Nat Immunol, 2011,12(9):861-869.

3 Fu Y, Yi Z, Wu X, et al. Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2011,49(12):4 246-4 251.

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6 World Health Organization. Global tuberculosis report 2012[S]. France:WHO Press, 2012: 23-24.

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Changes of the Expression of miR-29a and IFN-γ in Peripheral Blood Patients with Active Pulmonary Tuberculosis and Latent Tuberculosis

ZHAN Yu, LIU Shui-yi, WU Tang-wei, SHI Li-feng, LIU Yi-wen, ZHANG Hong-mei, WANG Hui, LU Zhong-xin

Department of Clinical Loboratory, The Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhaong University of Science and Technology, Wuhan 430014,China

Objective: To analyze the changes and correlations of the expression of miR-29a and IFN-γ in peripheral blood with active pulmonary tuberculosis and latent tuberculosis patients.Method: 49 cases of tuberculosrs patients were divided into two groups:active pulmonary tuberculosis group(n=27), latent tuberculosis group(n=22). 30 cases of non tuberculosis patients (control group) were enrolled. The expression level of miR-29a in the peripheral blood and IFN-γ mRNA in the peripheral blood mononuclear cells were detected with qRT-PCR. The level of IFN-γ of the serum was detected with ELISA. Differences between groups were analyzed. Results: The expression level of miR-29a in active pulmonary tuberculosis was significantly higher than those of control group and latent infection group (P<0.01). The IFN-γ expression level of cells in patients with active pulmonary tuberculosis and latent infection group were significantly lower than those of control group (P<0.01), and compared with the latent infection group, the expression of the active pulmonary tuberculosis was more significantly (P<0.05). The correlation analysis showed the expression level of miR-29a was negative correlated with the IFN-γ mRNA expression level, r value were -0.697, -0.559, respectively (P<0.05). Conclusion: miR-29a may play an important role in the development of the pulmonary tuberculosis by targeting IFN-γ.

Active pulmonary tuberculosis; Latent infection; miR-29a; IFN-γ

武汉市卫生和计划生育委员会科研项目(WX14C14)；武汉市中心医院院内科研基金(YQ13A04)

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院检验科，武汉 430014

本文2016-06-17收到，2016-08-02修回

R521

A

1005-1740(2016)04-0024-05