强直性脊柱炎及其相关基因HLA-B27检测的研究现状

白世杰　托娅　张保平　王丽娟　王雅菲



强直性脊柱炎及其相关基因HLA-B27检测的研究现状

白世杰1托娅2★张保平2王丽娟1王雅菲1

［摘要］强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是骶髂关节组织及中轴骨骼发生病变并伴发炎症及新骨形成的和自身免疫相关的慢性疾病，可伴有眼、胃肠道等器官病变，是一种致残率很高的疾病。1973年发现人类白细胞表面抗原B27（human leukocyte antigen-B27，HLA-B27）与AS之间具有相关性，随之HLA-B27的检测成为临床鉴别诊断AS的重要指标。本文就AS的研究现状及HLA-B27的检测手段做一综述。

［关键词］HLA-B27；强直性脊柱炎；致病机制；检测方法

★通讯作者：托娅，E-mail：antuoya@163.com

流行病学调查表明强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）多发于青少年，全球发病率为0.1%～0.9%，我国发病率为0.2%～0.45%［1］，男、女比例为3～6∶1。通常发病10年内便可出现骨关节活动障碍，并最终导致脊柱、骶髂关节发生不可逆病变［2］。目前的研究表明AS的发病原因可能与遗传因素，环境因素，免疫功能紊乱，微生物感染等有关系。随着医学技术的发展，人们对AS发病机制的研究得到进一步深入，但其具体的致病机理还没有得到统一的认识。近些年AS相关基

因人类白细胞表面抗原B27（human leukocyte antigen-B27，HLA-B27）的检测方法也在不断地更新换代，逐渐被分子生物学方法取代。本文就近些年对HLA-B27的结构、检测手段和AS致病机理的研究现状以及治疗手段做一综述。

1　HLA-B27与强直性脊柱炎的关联研究

1.1HLA-B27的亚结构及功能

HLA-B27位于人体第6号染色体短臂上，由8个外显子和7个内含子组成。其表达产物是HLA-B27分子，属于主要组织相容性复合体I类分子（major histocompatibility complex I，MHC I），由2条多肽链组成，分别为α链或重链、β链或轻链（非HLA-B27编码）。其中α链是一种跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区、胞内区3部分组成。胞外区含有一个抗原结合凹槽，在凹槽内有A、B、C、D、E、F 6个袋状结构能特异性结合9肽抗原分子，其中B结合袋由于其特殊的蛋白排列方式，能够特异的容纳抗原结构中精氨酸长长的侧链，是其他HLA-B分子所不具有的一种锚定方式。此外F结合袋在与抗原肽特异性结合过程中也有重要作用，它主要识别抗原结合肽的C末端残基，不同的HLA-B27亚型在选择识别抗原的过程中有所不同。轻链由15号染色体上非HLA基因编码，David等［3］利用鼠基因敲除模型发现敲除编码β 2M的基因的小鼠亦可发生关节炎，推测关节炎的发生主要和HLA-B27的重链相关。HLA-B27等位基因的多态性决定了HLA-B27分子亚型的多态性。由于HLA-B*2705在全世界范围内都有发现，通常把它看作是“祖基因”，其他亚型被认为是从B*2705进化而来［4］，如B*2705和B*2709在结构上仅有一个氨基酸的差别，但对疾病的预见却截然不同。

1.2HLA-B27与AS的相关性

1973年Brewerton等［5］发现HLA-B27与AS之间具有强遗传相关性，AS患者中HLA-B27的阳性率达到90%［6-7］，而在正常人中HLA-B27的阳性率仅为5%［8-9］。在对AS患者一级亲属的调查中发现，HLA-B27阳性者占31.3%，并且这些亲属患AS的相对危险率达87.4，其危险性高出正常家庭对照组10.8倍［10］。近些年，随着分子生物学技术的发展，截至2011年世界范围内鉴定出的HLA-B27亚型有155种之多。其中常见AS相关亚型有B* 2705、B*2704、B*2703、B*2702、B*2701等。其中白种人B*2705亚型占96%；非洲黑人以B*2703为主，占61%；中国汉族人群中，HLA-B*2705和HLA-B* 2704构成了HLA-B27的优势亚型，分别占40.68% 和50.85%［11］。综合来看，以B*2704与AS的关联性最强，其次是B*2705、B*2702和B*2707。目前的研究认为，B*2703和B*2707与AS呈负相关，B*2706和B*2709被认为是一种保护性基因［12］。其中B*2706广泛分布于东南亚人群中；B*2707主要存在于印度、中国和泰国人中；而B*2703和B*2709的分布分别局限于西非地区和意大利撒丁岛。马来西亚人中AS发病率很低，这可能就与B*2706的保护作用相关［13］。除HLA-B27基因外还有一些HLA其他位点的基因以及非MHC基因与AS具有相关性。

2　AS的发病机制

AS主要以中轴关节和大关节受累为主要表现，可累及内脏和其他组织，包括前葡萄膜炎、弥漫性间质性肺纤维化和虹膜睫状体炎等，发病后期典型X线表现为骶髂关节破坏，脊柱呈“竹节样”改变［14-15］。目前认为AS主要与遗传、环境、微生物感染等有关，但是具体的致病机理还未定论，主要的几种致病假说有：分子模拟假说、蛋白错误折叠理论、细菌感染学说等。

2.1分子模拟假说

研究发现某些微生物携带与人同源的肽段，可引起交叉反应［16-17］。正常情况下关节源性致命肽在正常人体中其递呈水平比较低，不能诱导免疫应答。而当含有某些同源性的蛋白的病毒或细菌感染时，则可致敏耐受的T淋巴细胞对低水平递呈的关节源致命肽进行识别，引起自身免疫反应并最终发展为AS。研究表明致病基因和保护性基因在识别抗原的过程中存在差别，Hülsmeyer等［18］发现，携带B*2705基因的AS患者体内存在血管活性肠肽受体衍生物（derived from vasoactive intestinal peptide type 1 receptor，pVIPR），而B*2709阳性个体无此抗原肽。B*2705可以2种不同的构象与pVIPR结合，而体外实验中B*2709结合pVIPR只有一种构象，B*2705以其中一种构象与pVIPR结合时能逃脱胸腺的阴性选择。Fiorillo等［19］发现，EB病毒的肽段潜在膜蛋白2衍生物与B*2705和B*2709结合时也呈现2种不同的构象，而且其与B*2705结合时的构象与B*2705/pVIPR相同，直接为该假说提供了证据。但该假说无法解释为什么一些HLA-B27阴性患者也会发生AS，而且在对转基因鼠炎症模型的研究中，发现它并不依赖CD8+T细胞。提示AS发病过程仍有其他因素作用。

2.2蛋白错误折叠理论

HLA-B27分子在内质网中的折叠速率非常的慢并且容易发生错误折叠。错误折叠的HLA-B27分子在内质网中不断积聚会触发内质网的应激反应，激活未折叠蛋白反应，并最终导致炎症的发生［20］。通过大鼠模型发现随着错误折叠的减少，关节炎的发生率也同时在减低［21］。相同条件下疾病弱相关或者负相关的基因亚型如HLA-B*2706 和HLA-B*2709表达的分子能够更加有效地进行折叠，这很好地解释了为什么不同基因亚型与AS的相关程度不同，此外，对相关致病基因折叠错误率高的研究可能为疾病的诊治提供新思路。

2.3细菌感染假说

AS和一些肠道病原菌的感染有关［22］，实验发现患者关节液内单核细胞增多，并富含相应菌体抗原。大样本调查中发现60%以上的AS患者都出现过肠炎症状，并且在疾病活动期进展为炎性肠病［23］。同时B27/β2M转基因鼠在无菌环境下不会发病，提示环境因素也是致病因素之一。

此外，目前对于MHC其他位点基因以及非MHC分子与AS发病关系的研究也比较深入［24］。在其他MHC基因中，HLA-60是目前被发现的仅次于HLA-B27的独立AS易患基因，并且此观点在对加拿大和日本人群研究中已经得到证实。非MHC分子的研究包括白介素、转化生长因子、神经丛蛋白等［25］。

迄今还没有一种说法能够完全解释AS疾病，对AS致病机制的研究仍在进行。任何一种疾病都不会由某单一组基因或某单一因素所掌控，而是复杂的网络调控的结果。因此，在AS致病机制的研究过程中，要从宏观到微观、从外环境因素到内环境因素、从蛋白表达到基因表达以及各种细胞因子之间的相互作用进行全面分析。

3　AS的诊断

目前针对AS的国际诊断标准主要是1966年的纽约标准和1987年的修订的纽约诊断标准。随着认识的不断深入，纽约诊断标准已不符合临床实际，因此国际上一般采用修订后的纽约诊断标准。修订后诊断标准［26］的主要内容包括：（1）临床标准：①腰痛、晨僵3个月以上，活动好转，休息无改善；②腰椎额状面和矢状面活动受限；③胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人；（2）放射学标准：骶髂关节炎分级双侧≥Ⅱ级或单侧Ⅲ～Ⅳ级，其中骶髂关节X线分级：0级为正常；Ⅰ级为可疑；Ⅱ级为轻度异常；Ⅲ级为明显异常；Ⅳ级为严重异常。（3）诊断：①肯定AS：符合放射学标准和一项（或以上）临床标准者；②可能AS：符合3项临床标准或符合放射学标准而不符合临床标准者。国内在1997年首届AS临床和流行病学全国协作组研讨会上制订了符合国内人群的AS诊断标准，但依旧以影像学为主。由于大多数患者都是在出现腰背不适等体征后才会就诊，甚至部分已经有了明显的影像学改变，而一般患者在患病早期不会出现明显的影像学改变，并且部分患者会出现误诊情况，导致AS延误确诊并影响预后。在这种情况下，对于AS的早期检查就显得尤为重要。

4　HLA-B27的检测方法及评价

目前关于HLA-B27的检测方法主要有补体依赖性细胞毒法、酶联免疫吸附试验法（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）、流式细胞术法（flow cytometry，FCM）和PCR法等几种主要的检测方法。

4.1补体依赖性微量细胞毒法

抗HLA-B27抗原的单克隆抗体可以与人类淋巴细胞表面HLA-B27抗原结合，在补体参与下，细胞膜被破坏而导致细胞死亡，阳性死亡细胞可被染料着色，使用倒置显微镜计数着色细胞的百分比可判定HLA-B27抗原的表达量从而进行疾病的诊断。此法是较早建立的检测HLA-B27的方法，具有操作简便、仪器设备要求不高、检测费用低等优点，适合于基层单位开展。其缺点是干扰因素相对较多，易受单抗效价、细胞纯度、补体差异以及HLA基因多态性的影响，易出现假阳性和假阴性，而且对标本量需求较大，标本不能长期保存。

4.2ELISA法

ELISA法将HLA-B27的单克隆抗体包被在微孔板上，加入待检血清进行孵育，洗去未被结合的游离抗原，加酶标抗体（根据检测抗原的不同可选择不同抗体，如抗CD45抗体、抗HLA-B27抗体等）和底物进行显色。使用酶标仪读取吸光度，将结果与标准孔对比判断结果。ELISA法是一种经典成熟的方法，具有操作简便、快捷无需特殊仪器等优点，极为适合基层医院开展。但多克隆抗体易与血清中的其他物质发生交叉反应。

4.3FCM法

流式细胞技术结合荧光标记的单克隆抗体，通过荧光标记技术迅速区分淋巴细胞亚群，并且通过单克隆抗体检测出CD3+淋巴细胞中HLA-B27抗原阳性的细胞百分比，结果根据流式细胞仪内置的临界值判定。此法优点是操作简便、快速、特异性高，稳定性好、标本用量少、重复性高，自动化程度高减少了人为因素的影响，弥补了前2种方法的缺点，是目前较为理想的方法。国外已将FCM法作为检测HLA-B27的常规方法［27-28］。缺点是仪器比较昂贵，目前只在较大的医院可以开展，容易出现荧光淬灭。此外，相对基因检测，抗原检测属于间接检测，仪器在判定结果的过程中存在“灰区”。

4.4序列特异引物聚合酶链反应（polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）

该方法最大的优势在于它在分子生物学基础上对HLA-B27基因进行定性分型。目前该法的应用已经比较成熟，可以在临床广泛开展。该法一定程度上避免的FCM法存在检测“灰区”的缺点，它根据等位基因的碱基差异设计引物，特异性扩增与其相应的等位基因。因此，有无PCR扩增产物是鉴定特异性等位基因的基础，PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳检出。检测时首先提取患者全血DNA，用血量更少，然后利用PCR技术进行产物扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判读。PCR扩增技术具有极大的检测灵敏度，同时带来了对检测错误进行放大的弊端。因此，PCR检测结果的报告必须慎重，必须有严格质控措施（如内参引物）并符合人类基因座位规则的情况下报告结果，对于人类稀有位点的报告必须重复测定。操作PCR基因扩增技术影响因素很多，操作不当会造成假阴性、假阳性结果。PCR临床实验室必须符合国家PCR实验室技术规范要求。此外，有些试剂盒对杂合子标本无法给出高分辨结果，需用基因测序方法进行区分［29-30］。

上述4种方法是目前检测HLA-B27的常用方法，补体依赖性微量细胞毒法因实验条件难以控制而逐渐被弃用；ELISA法操作简单快速，且无需特殊仪器，适用于中小医院开展以及大样本普查；FCM法以其操作简便、自动化程度高、重复性好等优点成为较理想的检测方法；PCR-SSP法近几年也逐渐被得到认可，对抗原弱表达的HLA-B27基因携带者检测优势尤为显著。在条件允许的情况下建议采取2种方法互补检测以提高检测的准确性。

5　AS的治疗

目前对AS的治疗手段极其有限，主要包括药物治疗和非药物治疗。药物治疗主要包括：抗风湿类药物，如非甾体类抗炎药、糖皮质激素以及环孢素A等；缓解症状的药物包括：甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、沙利度胺等。近些年研究发现肿瘤坏死因子-ɑ拮抗剂对非甾体类抗炎药治疗无效的患者有效，尤其对中轴病变短期治疗有效，但是长期疗效缺乏评估［31-32］。非药物治疗主要包括对患者进行健康教育，要求患者体育锻炼、康复理疗如睡硬板床等。手术治疗仅针对一些髋关节严重受累或者脊柱严重畸形的患者。

6　结语

AS属于一种临床上比较常见的自身免疫性炎性疾病，具有诊断困难、病程较长、晚期致残率高、治疗手段局限等特点，目前主要依靠影像学手段确诊。上世纪70年代发现HLA-B27与AS具有较强相关性，可作为AS早期诊断的辅助指标，使得AS的确诊率得到了大幅提高，也使HLA-B27成为了研究热点。近些年来，对HLA-B27的结构以及检测手段的研究逐渐向分子生物学领域延伸，使我们对它得到了更加深入的认识，也使检测手段更加灵敏。AS发病机制的研究成果包括分子模拟假说、蛋白错误折叠理论、微生物-宿主-AS间的相互作用以及细胞因子与AS间的相互作用等，各因素可能同时作用，也可能在疾病进展的各阶段分别作用，这也是我们对AS发病机制进一步研究的方向。AS的治疗仍以药物治疗为主，免疫抑制剂成为了目前的常规用药，而新型生物制剂的研发将会成为未来发展的方向。虽然各方面的研究已有了长足的进步，但仍有一些问题需要进一步研究去解答，比如HLA-B27抗原仅表达于有核细胞，缘何AS的发病却有明显的组织特异性等等。随着研究的深入以及检测手段的不断发展，这些问题都会得到解决，新的检测指标会不断被发现，将为AS的病情变化、治疗监测提供帮助。

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Research status of ankylosing spondylitis and the detection of its related gene HLA-B27

BAI Shijie1，TUO Ya2★，ZHANG Baoping2，WANG Lijuan1，WANG Yafei1
（1.Academy of Inner Mongolia Medical University，Huhhot，Inner Mongolia，China，010059；2.Department of Clinical Test Center，Affiliated Hospital Inner Mongolia Medical University，Huhhot，Inner Mongolia，China，010050）

［ABSTRACT］Ankylosing spondylitis（AS）is a chronic autoimmune disease which can cause inflammation and the formation of new bone in the sacroiliac joint tissue and the axial skeleton.AS is a high morbidity disease which is often accompanied by eyes，gastrointestinal，and other organ damage.In 1973，the correlation between human leukocyte antigen-B27（HLA-B27）and AS was found，and then the detection of HLA-B27 became an important indicator in clinical differential diagnosis of AS.This paper will summarize the research status of AS and the detection measure of gene HLA-B27.

［KEY WORDS］HLA-B27；Ankylosing spondylitis（AS）；Pathogenic mechanism；Detection methods

基金项目：内蒙古自治区自然科学基金（2014MS0854）；内蒙古医科大学附属医院重大科研项目（NYFY-ZD2012015）

作者单位：1.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古，呼和浩特010059 2.内蒙古医科大学附属医院临床检验中心，内蒙古，呼和浩特010050