2014年广州新塘地区手足口病病原体基因检测结果分析

杨勇　孙伟　李峥嵘　王丹



2014年广州新塘地区手足口病病原体基因检测结果分析

杨勇1★孙伟2李峥嵘3王丹1

［摘要］目的了解2014年广州新塘地区手足口病病原体分布情况。方法采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法对临床诊断为手足口病的患儿进行柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CoxA16）、肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）及肠道病毒（enterovirus，EV）基因检测。结果病毒核酸阳性率为28.48%（1 225/4 301），其中CoxA16 占20.73%（254/1 225），EV71占23.51%（288/1 225），EV占55.76%（683/1 225）。5月份就诊患儿最多，占22.20%（955/4 301）；5岁以下的患儿占89.98%（3 870/4 301），男孩与女孩比例为1.62∶1。结论2014年广州新塘地区手足口病病原体以EV为主，其次是EV71，主要分布于5岁以下儿童，5月份就诊患儿最多，男孩多于女孩。实时荧光RT-PCR方法在手足口病病原体检测中具有灵敏度高、简便、快捷、结果客观等优点，对手足口病的临床早期诊断、治疗及预防、控制具有重要意义，临床可推广、应用。

［关键词］手足口病；柯萨奇病毒A组16型；肠道病毒71型；肠道病毒；逆转录-聚合酶链反应

★通讯作者：杨勇，E-mail：yangyong1993@126.com

手足口病（hand-foot and mouth disease，HFMD）临床主要症状常表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹；多数呈良性过程，可治愈，少数可再发，但须高度警惕极少数中枢感染重症病例，预后差［1］。柯萨奇病毒A16型病毒（coxsackievirus A16，CoxA16）为本病常见的病原微生物，肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和其他柯萨奇病毒（如A5、A7、A9、A10、B3、B5）也可引起［2］。近年来，各地报告的病例数迅速增加，手足口病已成为重要的公共卫生问题。为了解广州新塘地区手足口病病原体分布情况，本文对2014年1月1日至2014年12月30日到我院儿科门诊及皮肤科门诊就诊临床诊断为手足口病患儿进行柯萨奇病毒A16型（CoxA16）、肠道病毒71型（EV71）及肠道病毒（enterovirus，EV）基因检测，对其结果进行分析，为当地手足口病的早期临床诊断、治疗和预防、监测、控制提供一定的参考。

1　资料与方法

1.1检测对象及诊断标准

对象为2014年1月1日至2014年12月30日在我院儿科及皮肤科就诊临床诊断为手足口病的患儿，年龄范围2个月～8岁，平均年龄2.9岁，男孩2 661例，女孩1 640例。诊断标准参照中国卫生部制订的《手足口病诊疗指南》（2010年版）的诊断标准［3］。鉴于重症病例均转上级定点医院，因此不在本研究范围中。

1.2取材方法

采集患儿发病3天内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，避免触及舌部及注意无菌操作。迅速将取材棉拭子置于采样管中，密闭。采集后的标本立即送检，不能立即检测的标本置于-20℃保存。

1.3仪器与试剂

实验所用仪器为DA7600基因扩增仪。采用广州中山大学达安基因股份有限公司的柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒、肠道病毒71型核酸检测试剂盒、肠道病毒通用型核酸检测试剂盒进行核酸检测。核酸检测试剂盒以CoxA16、EV71、EV基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增对CoxA16 RNA、EV71 RNA、EV RNA进行定性检测。3个试剂盒所用引物及荧光探针序列信息见表1。

表1　3个试剂盒所用引物及荧光探针序列信息Table 1　Primers and fluorescent probe sequence information for 3 kits

1.4样本处理与RNA提取

向无菌管中加入5 mL保存液，充分震荡摇匀，挤干棉拭子；充分振荡后离心，去掉部分上层液体直至剩余100 μL，吸打混匀放置于1.5 mL灭菌离心管，加入200 μL Trizol试剂及100 μL氯仿，用振荡器强力振荡20 s后静置3 min，然后12 000 rpm离心2 min；小心吸取无色上层液体，转移至新灭菌的1.5 mL离心管，然后加入10 μL RNA提取液A（充分混匀后吸取），再用振荡器充分混匀，8 000 rpm离心1 min后，小心弃去所有液体；加人溶液C 400 μL，充分振荡混匀，8 000 rpm离心l min，尽可能将液体去除干净；将装有沉淀的离心管于加热器中，60℃干燥5 min，待沉淀物完全烤干，然后加入30 μL DEPC H2O，吸打混匀管中沉淀，得到白色的悬浊液，可直接用于检测。

1.5PCR扩增

反应体系：RT-PCR反应液15 μL、逆转录酶2 μL、Taq酶3 μL；上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测样品混浊液、阳性质控品各5 μL，3 000 rpm离心30 s，放入PCR扩增仪。反应条件：40℃ 25 min，1个循环；94℃3 min，1个循环；93℃ 15 s，55℃45 s，40个循环。

1.6试验结果的判定

每次试验均检测阴性质控品、阳性质控品，满足质量控制要求时才进行检测结果的判定。阴性质控品：无典型S型扩增曲线或无Ct值。阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30。阴性检测结果判定标准：无典型S型扩增曲线或Ct值＞35.1。阳性检测结果判定标准：扩增曲线呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1。

1.7统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计，计数资料采用χ2检验进行分析，P＜0.05具有统计学意义。

2　结果

2.1荧光定性RT-PCR检测曲线图

阳性检测结果扩增曲线呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1。阴性检测结果无典型S型扩增曲线或Ct值＞35.1（图1）。

2.22014年广州新塘地区各月份及季节CoxA16、EV71、EV检测结果

2014年共收集标本4 301例，病毒核酸阳性率为28.48%（1 225/4 301），其中CoxA16占20.73% （254/1 225），EV71占23.51%（288/1 225），EV占55.76%（683/1 225）；5月份的就诊患儿最多占22.20%（955/4 301）。春夏两季就诊患儿较多共计3 372例，秋冬两季就诊患儿较少共计929例。CoxA16在不同季节流行情况的差异有统计学意义（χ2=21.20，P＜0.05），其中以春夏两季最高；EV71在不同季节流行情况的差异有统计学意义（χ2=20.26，P＜0.05），其中以春夏两季最高；EV在不同季节流行情况的差异无统计学意义（χ2=2.49，P＞0.05）。具体结果见表2、表3。

2.3手足口病不同性别感染情况

男孩2 611例，女孩1 640例，男孩多于女孩，男孩与女孩比例为1.62∶1。男孩阳性率为29.95% （797/2 661），女孩阳性率26.10%（428/1 640），差异有统计学意义（χ2=7.40，P＜0.05）。CoxA16阳性率男孩与女孩比较差异无统计学意义（χ2=0.07，P＞0.05），EV71阳性率男孩与女孩比较差异无统计学意义（χ2=0.05，P＞0.05），EV阳性率男孩与女孩比较差异无统计学意义（χ2=0.34，P＞0.05）。结果见表4。

表2　2014年广州新塘地区各月份CoxA16、EV71、EV检测结果Table 2　The results of CoxA16、EV71 and EV during 2014 in Xintang，Guangzhou

表3　2014年广州新塘地区各季节CoxA16、EV71、EV检测结果Table 3　The results of CoxA16、EV71 and EV in different seasons during 2014 in Xintang，Guangzhou

表4　手足口病不同性别感染情况Table 4　The different sexes infection of HFMD

2.4手足口病不同年龄段分布情况

按照手足口病患儿的年龄（0～1、1～5、5～）进行分组，在CoxA16病毒感染组中不同年龄组发病构成由低到高依次为0～1（1.85%）、5～（1.86%）、1～5 （7.87%），χ2=61.75，P＜0.05；在EV71病毒感染组中不同年龄组发病构成由低到高依次为0～1（2.16%）、5～（2.78%）、1～5（8.81%），χ2=63.31，P＜0.05；在EV病毒感染组中不同年龄组发病构成由低到高依次为5～（6.50%）、1～5（15.47%）、0～1（21.25%），χ2= 49.82，P＜0.05。1岁以下患儿974例，1岁至5岁患儿2 896例，5岁以上患儿431例；5岁以下患儿3 870例，占89.98%（3 870/4 301）。结果见表5。

表5　手足口病不同年龄段分布情况Table 5　The distribution of different ages of HFMD

3　讨论

手足口病于1957年新西兰首次报道，1958年分离出该病的常见病原体之一柯萨奇病毒A组16型，1959年被正式命名为手足口病，是一种全球性的儿童常见传染病之一。我国在2008年5月2日将该病作为第38种传染病列入《传染病防治法》按丙类传染病进行管理。

本次对广州新塘地区4 301例手足口病病原体进行检测分析，发现手足口病病原体病毒核酸检出率28.48%，其中CoxA16占20.73%，EV71占23.51%，EV占55.76%。EV71感染率略高于Cox16，以EV感染为主，这与近年来国内［4］国外［5-8］的资料相一致，提示在今后的临床工作中不能仅检测CoxA16和EV71，有条件的实验室应该开展其他肠道病毒的检测，以避免漏诊误诊的发生。疾病主要分布于5岁以下儿童，所以应该重视5岁以下儿童手足口病病毒检测和分型，可对进行疾病的早期诊断及治疗，有利于防止疾病的进一步恶化，能较好避免手足口病在本地区的流行爆发。男孩多于女孩（这可能与男孩生性好动活泼，与外界接触的途径较多有关）比例为1.62∶1，与马占忠等［9］报道较接近。患儿数从3月份开始增多，5月份最多，4～6月为高峰，春夏两季就诊患儿比秋冬两季就诊患儿多，9月份以后才开始逐渐下降，分析原因可能与人群聚集、气温波动较大、阴雨天气增加有关，与邱惠芳等［10］、杨兴林等［11］报道相一致。其中重型病例按卫生主管部门要求均转上级定点医院治疗。

目前检测手足口病病原体有病毒分离、抗体检测和核酸检测等方法。病毒分离该法需时间长、耗费多，对标本的运送、保存等技术条件要求相当高，只能在极少数大型的医学研究中心应用，绝大部分医院不能开展，目前仅用于研究；酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测抗体经济快速，但由于病毒感染到抗体出现需要一段时间，且需要急性期与恢复期双份血清，用于疾病的早期诊断灵敏度不高［12］。RT-RCR利用荧光共振能量转移的原理，是一种相对比较简单的分子生物学技术，具有特异性强、灵敏度高、速度快、定性准确、结果判断更为客观等优点，能及时检测手足口病病原体的特异性核酸，可满足疾病流行期间及时处理大量样本的需要，为手足口病的早期临床诊断、治疗和预防、监测、控制提供重要参考，具有良好的临床推广应用前景。

由于手足口病至今疫苗尚未研究成功，积极开展手足口病病原检测，提高早期病原学检测水平，有住于明确病原体不同时期分布特征及流行趋势，帮助本地区进行有针对性的控制预防。在手足口病流行季节，须加强疫情监测，重点在外来人群聚集区及托幼机构。对家长、幼儿园等托幼机构进行广泛有效的卫生知识宣传，早期发现、隔离患儿，帮助儿童养成良好的卫生习惯，以减少手足口病的发生与流行。

参考文献

［1］吴志华.临床皮肤性病学第1版［M］.北京：人民军医出版社，2011：187.

［2］张学军，陆洪光，高兴华.皮肤性病学第8版［M］.北京：人民卫生出版社，2014：70-71.

［3］中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南（2010年版）［EB/OL］.http：//www.moh.gov.en/publicfiles/ business/htmlfiles/mohyzs/83586/201004/46884.htm，2010-04-21/2015-12-31.

［4］顾红岩，刘志达，张玲，等.2013年北京地区手足口病住院患儿的病原分布及临床特点［J］.中华儿科杂志，2015，53（6）：459-463.

［5］BrachoMA，González-Candelas F，ValeroA，et al.Enterovirus co-infections and onychomadesis after hand，foot，and mouth disease，Spain，2008［J］.Emerg Infect Dis，2011，17（12）：2223-2231.

［6］Feder HM，Bennett N，Modlin JF.Atypical hand，foot，and mouth disease：a vesiculobullous eruption caused by Coxsackie virus A6［J］.Lancet Infect Dis，2014，14（1）：83-86.

［7］Fujimoto T，Iizuka S，Enomoto M，et al.Hand，foot，and mouth disease caused by coxsackievirus A6，Japan，2011［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（2）：337-339.

［8］Puenpa J，Chieochansin T，Linsuwanon P，et al. Hand，foot，and mouth disease caused by coxsackievirus A6，Thailand，2012［J］.Emerg Infect Dis，2013，19（4）：641-643.

［9］马占忠，黄文波，何凤屏，等.韶关市1190例手足口病病原体检测结果分析［J］.分子诊断与治疗杂志，2013，5（1）：30-31.

［10］ 邱惠芳，刘丹，刘青，等.浦东新区2012年手足口病检测结果分析［J］.海军医学杂志，2013，34（3）：176-178.

［11］ 杨兴林，李丽，熊金凤，等.2011年贵阳地区手足口病病原学检测结果分析［J］.实用医学杂志，2012，28 （12）：2081-2082.

［12］ 乔凤娇，刘红，刘汉芬.实时荧光PCR技术检测手足口病EV71与CA16病毒核酸［J］.中国卫生工程学，2011，10（3）：253.

Analysis on the gene detection results of hand-foot and mouth disease in the Guangzhou Xingtang area in 2014

YANG Yong1★，SUN Wei2，LI Zhengrong3，WANG Dan1
（1.Department of Dermatology，Hydropower Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511340；2.Department of Clinical Laboratory，Hydropower Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511340；3.Department of Paediatrics，Hydropower Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511340）

［ABSTRACT］ObjectiveTo find out the distribution of hand-foot and mouth disease（HFMD）pathogens in the Guangzhou Xintang area in 2014.MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to detect coxsackievirus A16（CoxA16），enterovirus 71（EV71）and enterovirus （EV）with HFMD.ResultsThe positive rate of the viral nucleic acid was 28.48%（1 225/4 301），CoxA16 accounted for 20.73%（254/1 225），EV71 accounted for 23.51%（288/1 225），EV accounted for 55.76%（683/1 225）.The peak of HFMD infection ratio was 22.20%（955/4 301）in May.Children under 5 years old accounted for 89.98%（3 870/4 301），the proportion of boys and girls was 1.62∶1.Conclusion EV was the major pathogen in the Guangzhou Xintang area in 2014，followed by EV71.The peak of HFMD was in May，mainly in children under the age of 5，and more prevalent in boys than girls.Real-time PCR can be used for pathogenic diagnosis of HFMD with the features of high sensitivity，simplicity，and efficiency，all of which play important roles in the early clinical diagnosis，treatment，prevention and control.

［KEY WORDS］Hand-foot and mouth disease；Coxsackie virus A16；Enterovirus 71；Enterovirus；Reverse transcription-polymerase chain reaction

作者单位：1.广东省水电医院皮肤科，广东，广州511340 2.广东省水电医院检验科，广东，广州511340 3.广东省水电医院儿科，广东，广州511340