一例Ⅰ型神经纤维瘤病患者的NF1突变检测及家系分析

过丹丹　卢鑫鑫　黄肖利　陈喜军　张彪　郑佳莹　伍严安，★



·论著·

一例Ⅰ型神经纤维瘤病患者的NF1突变检测及家系分析

过丹丹1卢鑫鑫1黄肖利2陈喜军2张彪1郑佳莹1伍严安1，2★

［摘要］目的对1例临床拟诊为Ⅰ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）患者进行致病基因突变研究。方法提取先证者及其家系成员外周全血基因组DNA，通过目标捕获二代测序技术（targeted next-generation sequencing，TNGS）对先证者Ⅰ型神经纤维瘤蛋白基因（neurofibromin 1，NF1）的全部编码区外显子及其侧翼序列进行高通量测序检测可疑突变，并用Sanger测序法进一步验证；对其家系成员NF1相同突变位点进行Sanger测序检测。结果基因检测发现先证者NF1第45号外显子1个已知致病突变c.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter），有类似临床表现的父亲和姐姐检出相同突变，表型正常的母亲和妻子未检测到此突变，其4岁儿子也检测出该突变。结论NF1的c.6790_ 6791insA（p.Tyr2264Ter）突变存在与该家系NF1的发病密切相关。

［关键词］突变检测；Ⅰ型神经纤维瘤病；NF1基因；目标捕获二代测序

★通讯作者：伍严安，E-mail：wyaslyy@126.com

Ⅰ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）（MIM#162200）是源于神经嵴细胞分化异常而导致多系统损害的常染色体显性遗传病，患病率约为1/2 500～1/3 000［1］。该病的临床表现为皮肤咖啡牛奶斑、雀斑、多发神经纤维瘤、虹膜Lisch结节、虹膜错构瘤、神经胶质瘤、骨骼异常等［2］。美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）于1988年提出了NF1的临床诊断标准，包括其中2项或2项以上即可诊断为NF1［3］。该病是由于Ⅰ型神经纤维瘤蛋白基因（neurofibromin 1，NF1）（MIM#613113）突变及表达异常所致［4-5］。本研究用目标捕获二代测序技术（targeted next-generation sequencing，TNGS）对一个NF1家系进行NF1突变的检测。

1　材料与方法

1.1研究对象

先证者，男，32岁，汉族，于2015年因全身皮肤多发性结节到福建省立医院皮肤科就诊，按照NIH的诊断标准拟诊为NF1。先证者的母亲、妻子表型正常，父亲和姐姐均有类似的皮肤表现。有一4岁儿子。家系图见图1。

1.2方法

1.2.1基因组DNA抽提

获得研究对象知情同意后，抽取该先证者、父母、姐姐、妻子及儿子的外周静脉血2 mL，均用EDTA抗凝。用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，德国）抽提全血基因组DNA。检测所提取DNA的浓度及纯度，质控标准为：DNA浓度＞100 ng/μL，总量＞5 μg，A260/A280比值范围在1.8～2.0之间。

1.2.2TNGS及数据处理

检测先证者合格的1 μg基因组DNA，使用超声波仪（Covaris S2，美国）进行随机打断，产生200～250 bp的随机片段。在片段两端加接头，进行文库构建。使用定制的2.1 M芯片（customized capture array）（Roche NimbleGen，美国）进行目标序列捕获。该芯片已经过大规模平行测序（massive parallel sequence，MPS）应用，显示有良好的敏感性和检测效率［6］。该芯片基因检测的目标区域捕获范围包括NF1全部外显子区域及其邻近10 bp的侧翼区。富集的 DNA库在 Illumina HiSeq2000测序平台上进行扩增并高通量测序。分别用SOAPsnp软件和Samtools分析单碱基变异和插入/缺失。建库、杂交、测序、序列比对及基因拷贝数变异分析的方法都与之前文章方法一致［6-7］。通过国际千人基因组计划（the 1000 genome project）、NCBI单核苷酸多态性数据库（NCBI dbSNP）、华大基因组数据库（BGI-DB）、人类基因突变协会（Human Genome Variation Society，HGVS）命名规则、人类基因突变数据库（the human gene mutation database，HGMD）等数据库，明确是否存在突变及其性质。

1.2.3Sanger测序验证

采用常规Sanger测序方法对先证者二代测序检出的可疑突变所在外显子区域进行测序验证。使用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。第45号外显子的上游引物序列：5′-CCGAGATTCAGTTTAGGAGTTA-3′；下游引物序列：5′-CGCTTGAGAACATACTATCCAT-3′，产物片段大小为376 bp。PCR反应体系：10×ExTaq buffer（Mg2+Plus）5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、20 μmol/L上下游引物各2 μL、DNA模板2 μL、ExTaq DNA聚合酶0.25 μL（TaKaRa，日本），去离子水补足至50 μL。用TP600PCR仪（TaKaRa，日本）进行PCR反应。PCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸50 s，共36个循环；72℃延伸10 min。取2.5 μL产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，对电泳显示在相应位置为清晰单一条带的PCR产物，用ABI3730测序仪（ABI，美国）进行DNA双向测序。用同样方法对先证者父母、姐姐、妻子及儿子进行45号外显子的Sanger测序。

2　结果

2.1临床特征

先证者自出生时即在躯干四肢发现几处褐色斑，随着年龄的增长，褐色斑逐渐增多增大，部分斑面增大发展为褐色斑片。青春期时，全身皮肤出现大量大小不一，呈粉红色或肤色的孤立性结节，半球形，质地软硬不等，部分有蒂，在面部、躯干、四肢均有分布，在躯干较多。曾因躯干部位结节摩擦导致疼痛多次手术切除治疗。体检在躯干四肢可见数百枚肿物，大小约为0.3～2.5 cm，触之柔软。在腋窝处可见大量大小不一的雀斑（图2A、B、C）。眼科检查在裂隙灯下双眼虹膜均可见2个以上的Lisch结节，患者身高1.51 m，智力正常，视力与听力正常，头颅及脊柱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）未见明显神经系统异常，未见其他系统疾病。姐姐皮肤有类似表现，另曾于6年前因左外耳后神经纤维瘤进行手术切除，现又复发（图2DE），MRI显示左侧外耳软组织浸润性病变。儿子4岁，躯干及四肢发现多处褐色斑，但无皮肤结节（图2F）。

2.2TNGS结果及生物信息学分析

对NF1全部编码区外显子捕获测序，目标区覆盖度达到100.00%，平均测序深度（×）约为597，目标区平均深度＞30×位点所占比例约为99%（图3）。在第45号外显子检测到一突变c.6790_ 6791insA（p.Tyr2264Ter），造成突变位点编码酪氨酸的密码子UAC变为终止密码子UAA，导致蛋白质的翻译提前终止，形成由2 264个氨基酸组成的截短多肽。经检索为报道过的突变［8］。

2.3Sanger测序验证及突变性质分析

Sanger测序证实了先证者存在c.6790_6791insA突变，其父亲、姐姐及4岁儿子也检测出该突变。表型正常的母亲和妻子未检测出此突变（图4）。

3　讨论

NF1定位于染色体17q11.2，包含57个组成性外显子和3个可变剪接外显子，全长283 kb，有3个大小为11～13 kb的成熟转录本。其蛋白产物为神经纤维瘤素，由2 818个氨基酸组成，大量表达于神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞、许旺细胞、肾上腺细胞、性腺细胞和白细胞。NF1是肿瘤抑制基因，其突变可干扰Ras循环的cAMP信号转导通路从而引发肿瘤［9］。NF1表达的丢失导致神经纤维素RasGAP功能的丧失，最终导致RAS活性的增加、细胞增生以及肿瘤的形成［10］。本研究通过TNGS和Sanger测序验证确定先证者家系存在遗传学病因——c.6790_6791insA突变。c.6790_ 6791insA造成突变位点编码酪氨酸的密码子UAC→UAA（终止密码子），导致蛋白质的翻译提前终止，形成仅有2 264个氨基酸组成的截短多肽，影响蛋白质结构。NF1是常染色体显性遗传性疾病，由于负显性效应机制导致患者患病。

NF1患者易患视神经胶质瘤和髓白血病，并可能出现认知功能障碍、血管畸形和骨骼畸形，NF1与多种组织和疾病的进展有关［11］。NF1异常增加了5倍的患恶性肿瘤的风险，有10%～13%NF1会发展为恶性外周神经鞘瘤［12］。本研究中先证者姐姐左外耳后神经纤维瘤手术切除后又复发，MRI显示左侧外耳软组织浸润性病变，不能排除恶变，因此需继续随访。其儿子目前只是躯干和四肢有多处褐色斑，没有皮肤结节。但由于经Sanger测序确定了其也存在NF1的c.6790_6791insA突变，因此可以预测到青春期，该患儿将会出现与先证者类似的皮肤结节临床表现。

NF1基因庞大、外显子多、缺乏明显的突变热点，在还没有TNGS技术以前，国内外有一些文献报道通过PCR扩增NF1基因全部外显子，再逐一Sanger测序检测突变，该方法较为繁琐。近年来出现的TNGS通过芯片对目标基因编码区及邻近剪接区的DNA进行捕获和富集，使用高通量测序平台可对多外显子基因和多种遗传病的相关基因进行突变检测。目前国内外已有少数文献报道通过TNGS对NF1进行突变检测［13-15］，显示该方法具有高效、准确的优势。本研究用TNGS准确地检测出了患者的NF1突变位点。这一结果提示，该技术是NF1诊断的有效手段，值得在临床应用。

国内对NF1患者进行基因检测只有少量报道。临床很少对NF1患者进行基因诊断的原因可能是因为其根据临床表现易于诊断，但对患者做基因检测有明显的益处。NF1作为常染色体显性遗传性疾病，有50%的遗传率。基因检测不仅可以在基因水平明确病因，还可以为患者及其家系成员提供产前诊断的依据，为其提供生育无NF1健康孩子的机会。

参考文献

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NF1 mutation detection and pedigree analysis in a patient with neurofibromatosis type 1

GUO Dandan1，LU Xinxin1，HUANG Xiaoli2，CHEN Xijun2，ZHANG Biao1，ZHENG Jiaying1，WU Yanan1，2★
（1.Provincial Clinical Medical College，Fujian Medical University，Fuzhou，Fujian，China，350004；2.Department of Clinical Laboratory，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou，Fujian，China，350001）

［ABSTRACT］ObjectiveTo identify the genetic ecology in a patient with neurofibromatosis type 1 （NF1）.MethodsThe genomic DNA was extracted from peripheral blood of the proband and his family members.All coding exons and the flanking sequences of neurofibromin 1（NF1）from the proband were screened by targeted next-generation sequencing（TNGS），the suspected mutation was validated by Sanger sequencing.Finally，the same mutation site was detected in his family members by Sanger sequencing. ResultsA known pathogenic mutation c.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter）was identified in the exon 45 of NF1 in the proband，his father and sister had similar clinical manifestations，but his mother and wife were asymptomatic.The same mutation was also detected in his 4-year-old son.ConclusionThe mutation ofc.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter）is closely related to the pathogenesis of the NF1 family.

［KEY WORDS］Mutation detection；Neurofibromatosis type 1；NF1 gene；Targeted next-generation sequencing

作者单位：1.福建医科大学省立临床医学院，福建，福州350004 2.福建省立医院检验科，福建，福州350001